Bioinformatics approaches for engineering L-tyrosine production in Escherichia coli

Abstract

A L-tirosina (L-Tyr) tem sido considerada um metabolito apelativo devido à sua ampla variedade de aplicações nas indústrias farmacêutica e química. Este metabolito é um importante precursor de vários metabolitos secundários ou produtos naturais. Estes compostos têm várias propriedades úteis, incluindo antioxidante, anti-inflamatória, anticancerígena, antiviral e antidepressiva. Há vários estudos onde são utilizadas estirpes de Escherichia coli (E. coli) sobre-produtoras de L-Tyr, mas ainda é necessário aumentar o seu rendimento para tornar o bioprocesso economicamente viável. Numerosas ferramentas computacionais têm sido desenvolvidas para a conceção de estirpes que identificam estratégias de modificação genética que aumentam a produção de bioquímicos. A construção de um mapa metabólico, e o desenvolvimento de modelos matemáticos e simulações que reproduzem dados experimentais e fenótipos em diferentes condições, permitem o desenho de células com apoio da computação. Os modelos cinéticos contêm um sistema de equações diferenciais que descrevem a evolução temporal das concentrações metabólicas, atividades enzimáticas e fluxos de reação, logo têm a capacidade de captar estas interdependências. O objetivo deste trabalho foi realizar a inserção in silico da via de L-Tyr num modelo cinético do metabolismo do carbono central de E. coli, o que permitiu identificar os melhores genes alvo para o desenho da estirpe de sobreprodução de L-Tyr. Três modelos estequiométricos (iML1515, iJO1366 e iJR904), bem como três modelos cinéticos (Millard, Oliveira e Jahan), foram utilizados para desenhar um modelo cinético que contivesse todas as reações necessárias para produzir L-Tyr. Este novo modelo foi, então, utilizado para testar diferentes estratégias de deleção e sobre-expressão para conceber uma estirpe sobre-produtora de L-Tyr de E. coli. Com o intuito de desenhar uma estirpe super-produtora de L-Tyr, foram utilizadas duas abordagens. Na primeira abordagem, os alvos obtidos pelo Metabolic Course Analysis (MCA) não melhoraram significativamente a produção de L-Tyr. Na segunda abordagem foram estudadas a via de produção de L-Tyr, bem como diferentes estratégias descritas em literatura que melhoram a produção de L-Tyr. Foi possível confirmar que a sobre-expressão dos genes limitadores de fluxo aroG, aroE, aroL, tyrA e tyrB melhora a produção de L-Tyr.

L-tyrosine (L-Tyr) has been considered an appealing metabolite due to its wide variety of applications in the pharmaceutical and chemical industries. This metabolite is an essential precursor of various secondary metabolites or natural products. These compounds have various valuable properties, including antioxidant, anti-inflammatory, anti-cancer, antiviral, and anti-depressant. There are several studies where Escherichia coli (E. coli) L-Tyr overproducing strains are used, but there is still a need to increase its yield to make the bioprocess economically feasible. Numerous computational tools have been developed for strain design to identify genetic modification strategies that increase targeted biochemical production. The construction of a biochemical network map, and the development of mathematical models and simulations that reproduce experimental data and phenotypes under different conditions, allow computer-aided cell design. Kinetic models yield a system of ordinary differential equations that describe the time evolution of metabolite concentrations, enzyme activities, and reaction fluxes, therefore potentially capturing these interdependencies. The aim of this work was to perform the in silico insertion of L-Tyr pathway in a kinetic model of the central carbon metabolism of E. coli, and to identify the best target genes for the design of the L-Tyr overproducing strain. Three stoichiometric models (iML1515, iJO1366 and iJR904) and three kinetic models (Millard, Oliveira and Jahan) were used to design an accurate model containing all the necessary reactions to produce L-Tyr. The new model was then used to test the different knock-in/out strategies to design an E. coli L-Tyr overproducing strain. In order to design an L-Tyr overproducing strain, two optimisation approaches were conducted. In the first approach, the targets obtained in the Metabolic Course Analysis (MCA) did not improve the L Tyr production significantly. In the second approach, the L-Tyr production pathway and different strategies described in the literature to improve L-Tyr production were tested. It was possible to confirm that the overexpression of rate-limiting genes aroG, aroE, aroL, tyrA and tyrB improve L-Tyr production.