Study of grapevine solute transporters involved in berry quality. A biochemical and molecular approach

Abstract

Due to its sessile nature, plants must take up mineral nutrients and water from the soil, and fix carbon in leaves from atmospheric CO2. The resulting photoassimilates must be precisely delivered to each plant organ, including leaves, roots and fruits. The present dissertation explored key biochemical mechanisms involved in the transport and compartmentation of sugars and water in grapevine. The fixation of carbon in chloroplasts, the synthesis of sugars in leaves and their transport to sink tissues are the most important biochemical steps in plant productivity, and have been investigated for several decades. Nonetheless, this is still a very relevant research topic because our knowledge is fragmented and the ongoing climate changes became an additional threat that may potentially affect plant productivity, in particular in grapevine. Plastids, which are characteristic of the plant kingdom, have pivotal roles in several important physiological processes. In grapevine, they are responsible for the accumulation of starch in woody tissues, roots, flowers and berries, and they are involved in the synthesis of secondary compounds. The first part of the present work was dedicated to the characterization of plastidial metabolism in grapevine, and focused on two plastidial glucose-6-phosphate/phosphate translocators (GPT), VvGPT1 and VvGPT2. It was found that three different splicing variants identified for VvGPT2 (VvGPT2α, VvGPT2β and VvGPT2Ω) were more expressed in the leaves. Contrarily, VvGPT1 was more expressed in mature berries, canes and flowers. Confocal microscopy revealed that VvGPT1 and VvGPT2Ω are localized in the plastidial envelope, and the transformation of pgi1-1 Arabidopsis mutant showed that these grapevine transporters mediate the uptake of glucose-6-phosphate into the plastid. In grape cell suspensions, ABA, light and galactinol, together with sucrose and fructose, increased the transcript abundance of VvGPT1. Furthermore, elicitation with MeJA dramatically increased the expression of VvGPT1 and VvPAL1, suggesting a role for GPTs in the production of secondary compounds in grapevine. Given its importance, this research line deserves further attention, particularly regarding the biochemical mechanisms underlying starch accumulation in grapevine amyloplasts during the winter, and its remobilization during spring to allow a fast vegetative growth. Besides sugar, water content is also an important parameter for berry quality, which is particularly intermingled with sugar status during berry development. Their content in the fruit is tightly regulated by the activity of sugar and water transporters (aquaporins – AQPs) in response to the environment. Berry and wine quality are directly affected by the berry water content at harvest. The second part of the present dissertation was devoted to the characterization of two AQPs in grapevine, VvSIP1 (Small Basic Intrinsic Protein 1) and VvXIP1 (Uncharacterized –X- Intrinsic Protein 1). Results showed that VvSIP1 was expressed in leaves and berries from field-grown vines, and in leaves and stems from in vitro plantlets, but not in roots. When expressed in tobacco mesophyll cells and in the yeast Saccharomyces cerevisiae, fluorescent-tagged VvSIP1 was localized at the ER. Stoppedflow spectroscopy showed that VvSIP1-enriched ER membrane vesicles from yeast exhibited higher water permeability and lower Ea for water transport than control vesicles, indicating the involvement of protein mediated water diffusion. This aquaporin was able to transport water but not glycerol, urea, sorbitol, glucose and inositol. VvSIP1-His-tag was solubilized and purified to homogeneity from yeast ER membranes and the reconstitution of the purified protein in phosphatidylethanolamine liposomes confirmed its water channel activity. XIPs are a new group of MIP proteins recently identified, so their precise physiological role has remained elusive. In our study, VvXIP1-RFP protein co-localized with ZmTIP2;1-YFP in the tonoplast of transiently transformed Nicotiana bethamiana leaves. Sopped-flow spectrometry performed with microsomal vesicles from yeast expressing pVV214-VvXIP1 showed that VvXIP1 is unable to transport water but transports glycerol. Plate growth assays showed that this AQP is also able to transport copper, boron and H2O2. Transcriptional analysis showed a much higher steady-state expression of VvXIP1 in leaves than in berries, canes or flowers from field grown grapevine. Furthermore, VvXIP1 transcripts were downregulated in leaves from plants treated with the copper-based fungicide Bordeaux mixture, and in vines under severe water deficit. In agreement, VvXIP1 was downregulated by ABA and salt stress in in vitro cultured grape cells. Much work is still needed to fully elucidate the physiological role of SIPs and XIPs in grapevine in particular towards the confirmation of their involvement in intracellular compartmentation of specific solutes like heavy metals. Thus, this avenue of research is still wide open.

Devido à sua natureza séssil, as plantas obtêm do solo os nutrientes minerais e a água e fixam o carbono nas folhas a partir do CO2 atmosférico. A água e os solutos orgânicos e inorgânicos são distribuídos com precisão pelos diferentes tecidos da planta, incluindo as folhas, as raízes e os frutos. O presente trabalho de doutoramento visou o estudo de mecanismos bioquímicos envolvidos no transporte e compartimentação de açúcares e de água nos tecidos/células de videira (Vitis vinifera L.) A fixação de carbono, a síntese de açúcares nas folhas e o seu transporte para os tecidos heterotróficos constituem os passos bioquímicos mais relevantes envolvidos na produtividade das plantas. Embora estes aspetos fisiológicos tenham sido alvo de investigação ao longo das últimas décadas o nosso conhecimento é ainda fragmentado, e as modificações climatéricas em curso representam uma limitação adicional à produtividade das plantas, em particular da videira. Os plastídios, que são organelos característicos do reino vegetal, desempenham papéis fundamentais em diversos mecanismos fisiológicos. Na videira, os plastídios são responsáveis pela acumulação de amido nos tecidos lenhosos, raízes, flores e frutos, e estão ainda envolvidos na síntese de compostos secundários. A primeira parte do presente trabalho foi dedicada à caracterização do metabolismo plastidial na videira, tendo-se focado em dois antiportadores plastidiais de glucose-6- fosfato com fosfato (GPT), VvGPT1 e VvGPT2. Os resultados demonstraram que três variantes de splicing alternativo do gene VvGPT2 (VvGPT2α, VvGPT2β e VvGPT2Ω), são mais expressos nas folhas do que noutros órgãos. Pelo contrário, o gene VvGPT1 demonstrou uma expressão mais elevada em bagos maduros, varas e flores do que nas folhas. Estudos de microscopia confocal demonstraram que as proteínas VvGPT1 e VvGPT2Ω localizam-se na membrana plastidial, e estudos de transformação estável do mutante de Arabidopsis pgi1-1 confirmaram o seu papel na incorporação de glucose-6- fosfato. Estudos desenvolvidos com células em suspensão sugeriram que alguns fatores ambientais, como a luz e sinais hormonais ou endógenos, como o ABA ou os níveis de açúcar (incluindo o galactinol, a sacarose e a frutose), conduzem a um aumento do número de transcritos do VvGPT1. Adicionalmente, a eliciação com MeJA conduziu a um aumento acentuado da expressão dos genes VvGPT1 e VvPAL1, sugerindo que os GPTs desempenham um papel importante na produção de compostos secundários na videira. Dada a sua importância, esta linha de investigação merece estudos mais aprofundados no futuro, em particular no que diz respeito aos mecanismos bioquímicos de remobilização do amido armazenado durante o inverno nos amiloplastos, permitindo o rápido crescimento dos gomos caulinares na primavera. A água constitui um parâmetro fundamental para a qualidade do bago de uva e os seus níveis encontram-se particularmente relacionados com a concentração dos açúcares durante o desenvolvimento e amadurecimento do fruto. Tem sido demonstrado que a atividade de transportadores membranares de açúcares e de água (aquaporinas – AQPs) regula com precisão a concentração destes compostos em resposta às condições ambientais. Em bagos maduros, o conteúdo em água afeta diretamente a qualidade do fruto e do vinho. A segunda parte do presente trabalho de doutoramento foi dedicada à caracterização de duas AQPs de videira, VvSIP1 (Small Basic Intrinsic Protein 1) e VvXIP1 (Uncharacterized – X - Intrinsic Protein 1). Os resultados demonstraram que o gene VvSIP1 foi expresso em folhas e bagos de videiras cultivadas em condições de campo, bem como em folhas e caules, mas não em raízes, de plântulas crescidas in vitro. Estudos de expressão transiente em células do mesófilo de tabaco e em Saccharomyces cerevisiae indicaram que a proteína de fusão VvSIP1-GFP localiza-se no retículo endoplasmático (RE). Ensaios de espectrometria de stopped-flow demonstraram que vesículas de membrana de RE purificadas de leveduras transformadas com a construção VvSIP1-GFP exibem uma maior taxa de permeabilidade à água e uma menor energia de ativação do que vesículas obtidas de leveduras controlo. Estes resultados sugeriram o envolvimento de um canal proteico no transporte de água. Ensaios de especificidade mostraram que a proteína VvSIP1 não transporta glicerol, ureia, sorbitol, inositol e glucose. A proteína quimérica VvSIP1-6his foi purificada a partir do RE de leveduras transformadas e a sua atividade transportadora reconstituída em lipossomas de fosfatidiletanolamina. Estes resultados permitiram demonstrar cabalmente que a proteína VvSIP1 é um canal transportador de água. As aquaporinas XIP foram identificadas recentemente, pelo que o seu verdadeiro papel fisiológico é ainda pouco claro. Estudos de expressão transiente em folhas de tabaco mediada por Agrobacterium, demonstraram que a proteína de fusão VvXIP1-RFP colocaliza com a proteína ZmTIP2;1-YFP, sugerindo tratar-se de uma proteína da membrana vacuolar. Estudos de espectrometria de stopped-flow com vesículas de membrana de leveduras transformadas com o vector pVV214-VvXIP1 demonstraram que a VvXIP1 é impermeável à água mas transporta glicerol. Experiências de crescimento em meio sólido mostraram ainda que esta AQP medeia o transporte de cobre, boro e H2O2. Em videiras cultivadas em condições de campo, estudos de PCR quantitativo em tempo real demonstraram que os níveis de transcritos do VvXIP1 são mais abundantes em folhas do que nos frutos, varas e flores. Em folhas de videiras tratadas com o fungicida à base de cobre calda bordalesa, bem como de videiras submetidas a stresse hídrico severo, a expressão do VvXIP1 é inibida. Em linha com estes resultados, a expressão do VvXIP1 foi reprimida pelo ABA e por stresse salino em culturas celulares. A elucidação completa dos papéis fisiológicos das SIPs e das XIPs na videira requer ainda trabalho de investigação intenso, em particular com vista à confirmação do seu envolvimento na compartimentação intracelular de solutos específicos, como metais pesados, pelo que esta linha de investigação se mantém aberta.