Development of an alginate and shellac microencapsulation system for phages: targeting intestinal foodborne bacterial pathogens on ruminant livestock

Abstract

This work consisted in the development of a microencapsulation system for the oral administration of bacteriophages (phages) to ruminants, to protect them during their passage through the rumen and the abomasum, releasing them later in the intestine. Ruminants are a major reservoir for some of the most relevant bacterial foodborne pathogens, such as human pathogenic Escherichia coli (e.g., Shiga Toxin-producing E. coli - STEC). Infections with these types of bacteria are often related to foodborne outbreaks, causing complications that can be fatal. Oral administration of phages, which are natural and highly selective antibacterial agents, is one of the most promising strategies to prevent these contaminations. The encapsulation method used was based on the extrusion of the polymers and allowed to form spherical microparticles, through the prilling by vibration technique followed by ionic gelation. Two natural, biodegradable, and biocompatible polymers were used, alginate and shellac (considered safe food additives by the European Food Safety Authority), under conditions of temperature, pH, and mechanical stress not harmful for phages. The microparticles optimized were composed of a mixture of 2 % (w/v) alginate and 3 % (w/v) shellac. By Wide-Field Microscopy, it was possible to determine that their average diameter was 488 ± 16 μm and that they had a spherical morphology. In vitro stability tests showed that the polymeric matrix remained intact at the temperature (38.5 °C) and pH values corresponding to the rumen (pH 5.8, 6.5 and 7) and abomasum (pH 3) and disintegrated at the pH corresponding to the intestine (pH 7.5). Scanning Electron Microscopy was used to verify that the microparticles had a porous surface and a compact interior. Confocal microscopy analysis showed that the 200 nm diameter fluorescent nanospheres, previously encapsulated to simulate phages remained encapsulated for three days of storage and were released when placed in TRIS buffer pH 7.5. The two phages selected as proof of concept were the E. coli phage T4 as a model and the phage CBA120, which is specific for STEC O157:H7, the most common strain of STEC. Phages were encapsulated within the polymeric matrix, then stability tests with encapsulated and free phages were performed, proving that encapsulated phages resisted more at pH 3, compared to free phages, which were totally inactivated at the same pH. These results allow us to conclude that the alginate and shellac microparticles developed in this work, present great potential as an encapsulation system that could help phages to reach the intestine in viable and effective quantities, thus eliminating the target bacteria present there. Subsequently, the method developed here may be applied to different phages and pathogenic bacteria to reduce the high number of foodborne diseases that occur worldwide and are considered a public health issue by the World Health Organization, representing a high socio-economic cost.

Este trabalho consistiu no desenvolvimento de um sistema de micro-encapsulamento para administração oral de bacteriófagos (fagos) a ruminantes, para protege-los durante a passagem pelo rúmen e abomaso, libertando-os posteriormente no intestino. Os ruminantes são um dos principais reservatórios de alguns dos patogénios alimentares bacterianos mais relevantes, como Escherichia coli patogénicas para humanos (ex. STEC, do inglês Shiga toxin-producing E. coli). As infeções por este tipo de bactérias estão frequentemente relacionadas a surtos de doenças alimentares, provocando complicações que podem ser fatais. A administração oral de fagos, que são agentes antibacterianos naturais e altamente seletivos, é uma das estratégias mais promissoras para evitar estas contaminações. O método de encapsulamento utilizado baseou-se na extrusão dos polímeros e permitiu formar micropartículas esféricas através da técnica de prilling by vibration seguida de gelificação iónica. Foram utilizados dois polímeros naturais, biodegradáveis e biocompatíveis, o alginato e a shellac (considerados aditivos alimentares seguros pela European Food Safety Authority), em condições de temperatura, pH e stress mecânico não prejudiciais para os fagos. As micropartículas optimizadas são constituídas por uma mistura de 2 % (w/v) alginato and 3 % (w/v) shellac. Através de Microscopia Wide-Field foi possível determinar que o seu diâmetro médio era de 488 ± 16 μm e que estas possuíam uma morfologia esférica. Os testes in vitro realizados mostraram que a matriz polimérica manteve-se intacta à temperatura (38.5 °C) e aos valores de pH correspondentes ao rúmen (pH 5.8, 6.5 e 7) e ao abomaso (pH 3) e desintegrou-se no pH respetivo ao intestino (pH 7.5). Foi utilizada Microscopia Eletrónica de Varrimento, que permitiu verificar que as micropartículas apresentavam uma superfície porosa e um interior compacto. A análise por Microscopia Confocal mostrou que as nano-esferas fluorescentes de 200 nm de diâmetro, encapsuladas previamente para simular os fagos, mantiveram-se encapsuladas durante três dias de armazenamento e foram libertadas quando colocadas em tampão TRIS pH 7.5. Os dois fagos selecionados como prova de conceito foram, o T4 que é um fago modelo de E. coli e o CBA120 que é específico para STEC O157:H7, a estirpe mais comum de STEC. Após o encapsulamento dos fagos na matriz polimérica, testes de estabilidade foram realizados com fagos encapsulados e livres, provando que os fagos encapsulados resistiram mais ao pH 3, comparativamente aos fagos livres, que foram totalmente inativados no mesmo pH. Estes resultados permitem concluir que as micropartículas de alginato e shellac desenvolvidas neste trabalho, apresentam grande potencial como sistema de encapsulamento que poderá ajudar os fagos a chegar ao intestino viáveis e em quantidades eficazes, eliminando assim as bactérias alvo aí presentes. Posteriormente, a técnica aqui desenvolvida poderá ser aplicada para diferentes fagos e bactérias patogénicas, no sentido de reduzir o elevado número de doenças alimentares que ocorrem mundialmente e são consideradas um problema de saúde pública pela Organização Mundial de Saúde, representando um elevado custo a nível socioeconómico.