Molecular biotechnology approaches towards the optimization of enzymes for advanced textile applications

Abstract

The challenges facing the textile finishing industry have intensified during the last decade. Current awareness of the negative environmental impact of chemical processing in textile industry, combined with increased strict legislation on industrial effluents, has led to the search for advanced, non-polluting processes, for treating both natural and synthetic fibre fabrics. Enzymes can represent good alternatives for the traditional textile processes allowing not only the reduction of costs, the protection of the environment, and increasing safety of employees but also contributing for the improvement of the quality and functionality of the final products. In the present work biotechnological approaches and genetic engineering methods were used aiming at the development and optimization of enzymatic eco-friendly processes for surface modification of synthetic and natural fibres. A general introduction is presented in Chapter 1 where an extensive bibliographic revision concerning the use of enzymes in textile industry is presented, through the identification and description of the major commercial processes, and the most recent developments obtained in this field. Chapter 2 deals with the surface modification of synthetic fibres by recombinant cutinase from the phytopathogenic fungus Fusarium solani pisi produced by molecular genetics tools. The Subchapter 2.1 is an introduction to the synthetic fibres utilized in the scope of this work. Subchapter 2.2 reports the structural modulation studies that allowed the identification of the aminoacids L81, N84, L182, V184 and L189 as targets to be substituted by Alanine allowing a better fit of large susbtrates in the active site of cutinase. All the mutations were obtained by site-directed mutagenesis and heterologously expressed in Escherichia coli. The genetically modified cutinase L182A presented higher stabilization on polyamide 6,6 (PA 6,6) and polyethylene terephthalate (PET) model substrates, a mutant variant that was chosen for further studies concerning the design and optimization of processes for functionalization of both fibres (Subchapters 2.3 and 2.4, respectively). Optimization of native enzyme was also performed, for the surface modificationof cellulose acetate, by creating chimeric fusions of the cutinase DNA coding sequence with either the fungal carbohydrate-binding module (CBM) of Cellobiohydrolase I, or the bacterial CBM of Endoglucanase C. The new recombinant cutinase fused to the fungal CBM presented higher hydrolysis of cellulose diacetate and improved the colour levels of the treated fabrics (Subchapter 2.5). The Chapter 3 describes the design of enzymatic-based technologies for wool fibres finishing industrial applications. Wool has the intrinsic characteristic to felt and shrink due to its scaly structure; the chlorine-Hercosett is the commercial process used to modify the scales of wool fibres with the purpose of providing resistance to felting and shrinkage. There have been several attempts to replace this chlorine process by proteases, in order to degrade scales, providing wool with anti-felting and antishrinkage characteristics. However, proteases commercially available can diffuse inside the fibre causing unacceptable damages. In this thesis two novel approaches were followed to increase molecular weight of the subtilisin E by genetic engineering. Polyenzymes composed of two and four subtilisin E coding sequences fused in frame were constructed. Additionally, another chimeric subtilisin was obtained by 3´-terminus fusion with the nucleotidic sequence coding for the human neckdomain of surfactant protein D. All chimeric subtilisins were cloned and overexpressed into E. coli but the soluble and active forms were not attained, regardless the expression system or the strain used, under the culture conditions tested (Subchapter 3.2). Subchapter 3.3 describes the fusion of subtilisin E gene in frame with the DNA coding an elastin-like polymer containing 220 repeats of the monomer VPAVG. With this strategy the construction of a chimeric enzyme presenting a molecular weight above 116 kDa was achieved. Wool yarns treated either with commercial or chimeric enzyme showed a size-dependent diffusion process: the commercial enzyme penetrated into wool cortex while the chimeric one was retained at the surface, in the cuticle layer. These results represent a major achievment: the production of a recombinant high molecular weight protease, for wool surface controlled-hydrolysis, is reported for the first time. Chapter 4 presents a general discussion, the major conclusions and gives some perspectives for continuing the work in this research field.

Os desafios que a indústria têxtil enfrenta têm-se intensificado na última década, especialmente devido ao impacto ambiental provocado pelos químicos derivados dos acabamentos das fibras têxteis. Concomitantemente, a legislação cada vez mais restrita no que respeita aos efluentes têxteis levou a uma procura de soluções avançadas, nãopoluentes, para o tratamento de fibras naturais e sintéticas. A aplicação de enzimas representa uma alternativa promissora aos processos químicos tradicionais, permitindo uma redução de custos e representando simultaneamente, vantagens no que concerne à protecção ambiental, ao aumento da segurança dos trabalhadores e à melhoria da qualidade e da funcionalidade do produto final. No presente trabalho seguiu-se uma abordagem biotecnológica, com recurso às técnicas de engenharia genética, com vista ao desenvolvimento e optimização de métodos enzimáticos, eco-sustentáveis, com aplicação na modificação da superfície de fibras têxteis naturais e sintéticas. O capítulo 1, correspondente à introdução geral, apresenta uma revisão bibliográfica do uso de enzimas na indústria têxtil através da identificação e descrição dos processos enzimáticos já implementados ao nível comercial, bem como da investigação e dos resultados mais recentemente obtidos nesta área. No Capítulo 2 apresentam-se as estratégias de modificação da superfície de fibras sintéticas por acção da enzima cutinase, originária do fungo fitopatogénico Fusarium solani pisi, produzida por expressão heteróloga em Escherichia coli. No Subcapítulo 2.1 apresenta-se uma introdução teórica às fibras sintéticas utilizadas no âmbito deste trabalho. No Subcapítulo 2.2 descrevem-se os estudos de modelação estrutural da cutinase que permitiram a identificação dos resíduos aminoacídicos L81, N84, L182, V184 e L189 como alvos de substituição pelo aminoácido Alanina, viabilizando acomodar substratos de maior dimensão no centro activo. As mutações referidas foram obtidas recorrendo à técnica de mutagénese dirigida. A cutinase geneticamente modificada L182A apresentou uma maior estabilidade com os substratos modelo da poliamida 6,6 (PA 6,6) e do polietileno tereftalato (PET), tendo sido seleccionada para estudos ulteriores com vista ao desenho e optimização de processos de funcionalização das fibras sintéticas referidas (Subcapítulos 2.3 e 2.4, respectivamente). A cutinase nativa foi ainda utilizada para a modificação da superfície da fibra acetato de celulose. Foram efectuadas duas construções quiméricas pela fusão do gene da cutinase com o módulo de ligação a carbohidratos (CBM) de origem fúngica, presente na enzima Cellobiohydrolase I e com o CBM de origem bacteriana, presente na enzima Endoglucanase C. Verificou-se que a enzima recombinante, fundida com o CBM de origem fúngica, apresentou maior actividade hidrolítica sobre o diacetato de celulose e aumentou os níveis de tingimento das fibras (Subchapter 2.5). O Capítulo 3 descreve o desenho de tecnologias baseadas em processos enzimáticos para aplicação industrial do acabamento da lã. A tendência da lã para feltrar e encolher é devida principalmente à sua estrutura em forma de escamas. O tratamento antifeltragem, normalmente utilizado para modificar as escamas das fibras de lã, utiliza cloro, pelo que, têm sido conduzidas abordagens para substituir este processo por uma alternativa mais ecológica, nomeadamente pelo recurso a proteases. Contudo, devido ao seu tamanho, as proteases difundem-se no interior da fibra, atacando não só a cutícula mas também o córtex, o que provoca danos inaceitáveis do ponto de vista comercial. Os Subcapítulos 3.2 e 3.3 descrevem as estratégias utilizadas para aumentar o peso molecular da protease subtilisina E através de técnicas de engenharia genética. Foram construídas duas poli-enzimas compostas por duas e por quatro repetições da unidade codificante, clonadas na mesma fase de leitura. Além disso, construiu-se ainda uma fusão da sequência nucleotídica da subtilisina E com a sequência codificante do neckdomain da proteína humana surfactante D. Todas as proteínas recombinantes referidas foram sobre-expressas mas, independentemente do sistema de expressão ou da estirpe usada, não foi conseguida a sua recuperação na forma solúvel e activa nas condições testadas (Subcapítulo 3.2). No Subcapítulo 3.3 descreve-se a fusão da sequência codificante da subtilisina E com a sequência nucleotídica que codifica um polímero elastomérico contendo 220 repetições do monómero VPAVG. A enzima quimérica obtida apresentou um peso molecular superior a 116 kDa. Quando comparada com uma protease comercial constatou-se que a difusão das enzimas no interior da lã era dependente do peso molecular das mesmas: a de origem comercial, de baixo peso molecular, penetrou no córtex, por outro lado a enzima quimérica, de elevado peso molecular ficou retida à superfície na cutícula da fibra. Estes resultados representam um grande avanço para o objectivo deste trabalho uma vez que constitui o primeiro caso de sucesso, referido na literatura, em que foi consegida a produção de uma protease recombinante de elevado peso molecular, aplicável à hidrólise controlada da superfície da lã. O Capítulo 4 apresenta a discussão geral, as principais conclusões e algumas perspectivas que direccionam para a continuidade do trabalho desenvolvido nesta linha de investigação.