New generation antigen delivery system for Candida albicans recombinant proteins as a vaccination strategy against systemic fungal infections

Abstract

Over the past five decades, a rise in numbers of immunocompromised individuals has led to a significant increase in invasive fungal infections, including those caused by Candida albicans. This has created a pressing need for innovative approaches to combat these fungal pathogens. While several immunotherapeutic strategies and vaccines are in development, none have reached clinical use yet. Previous work emphasised the potential of liposomal formulations containing C. albicans cell wall surface proteins (ADS1) as a vaccine candidate, highlighting chitinase 3 (Cht3) as a promising antigen. A monovalent formulation incorporating DODAB:MO liposomes with purified, recombinant, P. pastoris-produced, Cht3 was prepared. Cht3 displayed stability and activity across a wide pH range (pH 3-9) and at elevated temperatures (up to 50-60 ºC), making it suitable for liposomal inclusion. Cht3 hydrolysed chitin and chito-oligomers into smaller chito-oligomers, with chitobiose being the principal end-product but with chitotriose and the monomer N-acetylglucosamide being also produced. Cht3 liposomes (DMC) showed enhanced antigen delivery and cellular internalisation compared to ADS1, eliciting a Th1/Th17 immune response and generating substantial levels of opsonising antigen-specific IgG and IgG1 antibodies. A divalent formulation (DMCS) including Cht3 liposomes and a new antigen, the C. albicans protease Sap2, was also prepared. DMCS maintained liposome characteristics and induced cytokine production similar to DMC but surprisingly provided greater protection against systemic infection, likely due to a stronger Th1/Th2 immune response, with a higher IFN-γ/IL-4 ratio, trained immunity, and higher antigen-specific IgG response. The role of Cht3 in C. albicans virulence was explored using knockout mutants, revealing a decrease in virulence with CHT3 deletion. In vitro studies showed no significant differences in physiological characteristics, but the release of small chito oligomers by Cht3 with potential immunomodulatory effects could play a role in virulence. The results obtained in this thesis signify a significant advancement in the field by introducing novel specific antigen formulations and confirming DODAB:MO as an effective delivery system and adjuvant. DMCS emerges as a promising candidate, demonstrating enhanced protection and immune response. Additionally, it highlights chitinase activity as a virulence factor in C. albicans infections and the complex interaction between chitinases and chito-oligomers. Further studies will delve into these interactions and their implications for fungal infection therapies.

Nas últimas cinco décadas, o aumento no número de indivíduos imunocomprometidos levou a um aumento significativo de infeções fúngicas sistémicas, incluindo as causadas por Candida albicans. Este aumento criou uma necessidade urgente para abordagens inovadoras para combater estes fungos patogénicos. Embora várias estratégias imunoterapêuticas e vacinas estejam em desenvolvimento, nenhuma alcançou o uso na clínica. Trabalhos anteriores enfatizaram o potencial de formulações lipossomais contendo proteínas da superfície da parede de C. albicans (ADS1) como candidatas a vacinas, destacando a quitinase 3 (Cht3) como um antigénio promissor. Uma formulação monovalente foi produzida, incorporando lipossomas DODAB:MO com Cht3 recombinante purificada produzida em P. pastoris. Cht3 apresentou estabilidade e atividade numa ampla gama de pH (pH 3-9) e em temperaturas elevadas (até 50-60 ºC), tornando-a adequada para incorporação nos lipossomas. Cht3 hidrolisou quitina e quito-oligómeros em quito-oligómeros menores, sendo a quitobiose o principal produto final, mas com a quitotriose e o monómero N-acetilglucosamida a também serem produzidos. Os lipossomas com Cht3 (DMC) mostraram melhor entrega de antigénio e internalização celular em comparação com ADS1, induzindo uma resposta imune Th1/Th17 e gerando níveis substanciais de anticorpos IgG e IgG1 específicos e opsonizantes. Uma formulação divalente (DMCS) incluindo lipossomas com Cht3 e um novo antigénio, a protease Sap2 de C. albicans, também foi preparada. DMCS manteve as características dos lipossomas e induziu uma produção de citocinas semelhante a DMC, mas surpreendentemente induziu maior proteção contra uma infeção sistémica, provavelmente devido a uma resposta imune Th1/Th2 mais forte, com um rácio IFN-γ/IL-4 mais alto, imunidade treinada e maiores níveis de IgG específicos. O papel da Cht3 na virulência de C. albicans foi explorado usando mutantes knockout, revelando uma diminuição na virulência com a deleção de CHT3. Estudos in vitro não mostraram diferenças significativas nas características fisiológicas, mas a libertação de pequenos quito-oligómeros pela Cht3, com potenciais efeitos imunomoduladores, poderia desempenhar um papel na virulência. Os resultados obtidos nesta tese significam um avanço significativo nesta área ao introduzir novas formulações de antigénios específicos e a confirmar o DODAB:MO como um sistema de entrega e adjuvante eficaz. DMCS surge como um candidato promissor, demonstrando maior proteção e resposta imunológica. Além disso, destaca a atividade da quitinase como fator de virulência em infeções por C. albicans e a complexa interação entre quitinases e quito-oligómeros. Mais estudos irão aprofundar essas interações e suas implicações para terapias de infeções fúngicas.