C. elegans ataxin-3: function, loss of function and molecular partners

Abstract

Ataxin-3 is the protein involved in Machado-Joseph Disease, one of the nine polyglutamine (polyQ) disorders identified to the date. These are characterized by a polyQ expansion in the corresponding proteins, the presence of ubiquitylated inclusions and selective neuronal death. Although a toxic gain of function has been proposed as the common pathogenic mechanism underlying ali these diseases, it is believed that partial loss of the normal function of the proteins may also contribute and modulate disease progression. Human ataxin-3 binds ubiquitin, ubiquitylated substrates, is a deubiquitylating (DUB) enzyme in vitro which suggests a role in the ubiquitin-proteasome pathway (UPP). Ataxin-3 is also able to bind to histones and transcriptional repressor complexes hinting a link with transcriptional repression. In this study, we explored the function, loss of function and molecular partners of the C. elegans ataxin-3 orthologue, ATX-3. We found that the worm protein is highly similar to the human protein at a sequence and structural level and has DUB activity in vitro as the counterpart. We showed that ATX-3 is expressed in several cell types (neurons, muscle, spermatheca, intestinal cells) and from embryonic stages until adulthood. Considering the proposed role for ataxin-3 in transcriptional repression and also in order to analyze the physiological effects of the absence of ATX-3, we analyzed two C. elegans ATX-3 knockout strains, the first models of ataxin-3 deficiency to be characterized. These animals are viable and with no overt phenotype in basal conditions, although they show a distinct transcriptomic profile, with several genes altered in the two mutant strains. We identified several ataxin-3 interactors and characterized more extensively some of them. Of these, some were already known as VCP/p97 (CDC-48 in worms), alpha-tubulin and HSP-90 (DAF¬21 in worms). Of the novel interactors, a large proportion were structural/cytoskeletal proteins, muscular proteins and components of the UPP. As an example, we characterized a novel trimolecular complex formed by ATX-3, the CDC-48 and the UBXN-5 protein, which is probably involved in the shuttling of ubiquitylated proteins to the proteasome. Additionally, we also identified some potential targets of this complex. Another ataxin-3 interactor is the ubiquitin-Iike protein Nedd8, and it is known that human ataxin-3 has deneddylase activity. Although we showed that this interaction is conserved in worms, we did not observe any differences in the global neddylation pattern of ATX-3 mutants, therefore the biological relevance of this interaction remains unanswered. We also analyzed the effects of ATX-3 absence in muscle and found that paramyosin (UNC-15) was accumulating in ATX-3 mutants at a stress-treshold situation, 25°C. This accumulation seemed to occur due to inefficient degradation of UNC-15 in ATX-3 knockout animals. Even though the muscle of these animais was apparently normal at a structural level, they showed a significant motility defect at 25°C, suggesting that ATX-3 has a Iink with muscle maintenance and/or function. Considering the role of ataxin-3 in the protein degradation pathway, we studied the ATX-3 mutants in a situation where the protein homeostasis was compromised, i.e. after an heat insult. In this situation, the ATX-3 mutants were significantly more resistant to heat stress than wild type. This phenotype was explained by the upregulation of several chaperone proteins, as analyzed by proteomic studies. Lastly, we showed that both human and worm interact with alpha-tubulin and are microtubule-associated proteins. Concordant with a role of ataxin-3 in cytoskeleton, cells with low ataxin-3 expression have an abnormal cell shape, reduced cell-cell interconnectivity and a clear cytoskeletal disorganization, the intermediate filament and the microtubule networks being severely compromised. In summary, this work provided new c1ues about ataxin-3 biological function and pathways where it is involved. It reinforced ataxin-3' s involvement with the UPP and it also raised new hypotheses for its role in cytoskeleton organization and in muscle maintenance.

Ataxina-3 é a proteína envolvida na Doença de Machado-Joseph, uma das nove doenças de poliglutaminas (poliQ) identificadas até à data. Este grupo de doenças é caracterizado por uma expansão de poliQ nas proteínas correspondentes, pela presença de inclusões ubiquitiladas e morte neuronal específica. Apesar de ser proposto que um ganho tóxico de função é o mecanismo patogénico destas doenças, a perda parcial da função normal das proteínas também pode contribuir e modular a progressão da doença. A ataxina-3 humana liga-se a ubiquitina, a substratos ubiquitilados e é uma ubiquitina hidrolase in vitro, sugerindo um papel na via ubiquitina-proteassoma (UPP). A ataxina-3 também é capaz de se ligar a histonas e a complexos repressores da transcrição, indicando uma possível associação com a repressão da transcrição. Neste estudo, explorámos a função, a perda de função e os parceiros moleculares do ortólogo da ataxina-3 em C. elegans, ATX-3. Descobrimos que a proteína do nemátode é muito similar à humana a nível de sequência e estrutura, e, tal como a ataxina-3 humana, possui actividade de ubiquitina hidrolase in vitro. Demonstrámos que a ATX-3 é expressa em vários tipos de células (neurónios, músculo, espermateca, células intestinais) e desde estadios embrionários até à fase adulta. Considerando o papel da ataxina-3 na repressão da transcrição, e também de forma a analisar os efeitos fisiológicos da sua ausência, estudámos duas estirpes knockouts para a ATX-3 em C. elegans, os primeiros modelos a serem caracterizados com deficiência em ataxina-3. Estes animais são viáveis e não possuem fenótipo visível em condições fisiológicas normais, no entanto apresentam um perfil transcriptómico distinto, com vários genes alterados nas duas estirpes knockouts. Identificámos vários parceiros moleculares da ataxina-3 e caracterizámos mais extensivamente alguns deles. Dos interactores identificados, alguns já eram conhecidos, tais como a VCP/p97 (CDC-48 nos nemátodes), alfa-tubulina e HSP90 (DAF-21 em C. elegans). Dos novos interactores, uma grande percentagem eram proteínas estruturais ou do citosqueleto, proteínas musculares e componentes da UPP. Caracterizámos um novo complexo trimolecular formado por ATX-3, CDC-48 e a proteína UBXN-5, que provavelmente está envolvido na translocação de proteínas ubiquitiladas para o proteassoma. Adicionalmente, também identificámos possíveis alvos deste complexo. Outro interactor da ataxina-3 é a proteína tipo ubiquitina Nedd8, e é sabido que a ataxina-3 humana tem actividade de desnedilase. Apesar de mostrarmos que esta interacção é conservada em C. elegans, não observarmos diferenças no padrão geral de nedilação nos mutantes para a ATX-3, por isso o significado biológico desta parceria permanece obscuro. Também analisámos os efeitos da ausência da ATX-3 no músculo, e descobrimos que a paramiosina (UNC-15) estava aumentada nos mutantes ATX-3 numa condição de crescimento a 25°C. O aumento de UNC-15 parecia ser causado por uma degradação ineficiente desta proteína. Apesar do músculo deste animais ser aparentemente normal a nível estrutural, eles têm um deficit motor a 25°C, incitando que a ATX-3 tem uma associação com a manutenção e/ou função do músculo. Considerando o papel da ataxina-3 na via de degradação de proteínas, examinamos os mutantes ATX-3 numa situação fisiológica onde a homeostasia celular proteica estava comprometida, i.e., após um choque térmico. Os mutantes ATX-3 são mais termoresistentes que os animais selvagens. Este fenótipo pode ser explicado pela sobreexpressão de várias chaperones moleculares, como confirmado pelos estudos de proteómica quantitativa. Por fim, mostrámos que a ataxina-3 humana e do nemátode interactuam com a alfa-tubulina e que se ligam aos microtúbulos in vitro. Condizente com uma possível função da ataxina-3 no citosqueleto, células com níveis baixos de ataxina-3 têm uma forma celular anormal, uma conectividade intercelular reduzida, e uma desorganização do citosqueleto grave, com os filamentos intermédios e os microtúbulos completamente comprometidos. Em sumário, este trabalho originou diversas pistas acerca da função biológica da ataxina-3 e vias onde está envolvida. Confirmou o envolvimento da ataxina-3 com a UPP e também levantou novas hipóteses acerca do seu envolvimento na organização do citosqueleto e na manutenção do músculo.