The role of KRAS mutations in the modulation of BAX and glycolytic metabolism using yeast as a model

Abstract

O KRAS pertence à família de proteínas RAS GTPase, responsáveis pela regulação de várias vias de sinalização relacionadas com o controlo de importantes funções celulares, tais como a apoptose e o metabolismo. As mutações oncogénicas do KRAS são as mutações de ganho de função mais frequentes no cancro colorretal (CCR), afetando cerca de 30-50% dos pacientes. As proteínas da família RAS desempenham geralmente um papel anti-apoptótico, mas o papel das mutações do KRAS na regulação da apoptose encontra-se pouco elucidado. A ativação das vias anti apoptóticas também é uma consequência da adaptação metabólica nas células cancerígenas. Na verdade, as células de CCR que expressam mutações de KRAS são capazes de adaptar o seu metabolismo celular, de forma a favorecer a progressão tumoral. Na presente tese, questionámos o papel do KRAS humano mutado na regulação da apoptose e na sua interação com a mitocôndria, em especial com a proteína pró-apoptótica BAX, e na regulação do metabolismo glicolítico, usando a levedura Saccharomyces cerevisiae como modelo. Para isso, usámos a levedura a expressar diferentes isoformas do KRAS humano, KRASWT , ou as formas mutantes ativadoras mais frequentes no CCR, KRASG12D, KRASG12V ou KRASG13D , um modelo já estabelecido no nosso laboratório. A fim de avaliar a influência das diferentes isoformas de KRAS na atividade da BAX, estas células de leveduras foram co-transformadas com a proteína BAX humana. Relativamente à regulação da apoptose, os nossos resultados mostraram que as mutações de KRAS conferem resistência à morte celular induzida por BAX em levedura, comparando com KRASWT, o qual induz ainda libertação de citocromo c. Para explicar a interação das duas proteínas, demonstramos também que BAX e as isoformas de KRAS se encontram ambas na mitocôndria e interagem fisicamente. Mostrámos ainda que as mutações de KRAS aumentam a suscetibilidade à morte induzido por ácido acético em células que expressam BAX, contrariamente ao KRASWT . Em relação ao papel do KRAS mutado na adaptação metabólica, os nossos resultados corroboram a ideia de que as células que expressam mutações de KRAS são capazes de adaptar o seu metabolismo celular, de acordo com a fonte de carbono disponível no meio extracelular. Por um lado, em meio que contém glucose, estes mutantes favorecem a fermentação relativamente à respiração. Por outro lado, em meio que contém ácido lático, os mutantes de KRAS favorecem a respiração, resultando ainda em taxas específicas de crescimento mais altas, em comparação com o KRASWT. De modo geral, os nossos resultados suportam a ideia de que as mutações oncogénicas de KRAS favorecem a progressão tumoral, através da resistência conferida à morte induzida por BAX e da capacidade de adaptação metabólica em ambiente tumoral que apresenta elevados níveis de lactato.

KRAS belongs to the GTPase RAS superfamily which regulates several cell-signaling pathways involved in the control of important cellular functions, including apoptosis and metabolism. Oncogenic mutations in KRAS are considered the most common gain-of-function mutations and affect 30-50% of the colorectal cancer (CRC) patients. RAS proteins usually have an anti-apoptotic role, but little is known about the role of KRAS mutations in apoptosis regulation. The activation of anti-apoptotic pathways is also a consequence of the metabolic adaptation in cancer cells. In fact, CRC cells harboring KRAS mutations can adapt their cellular metabolism in order to favor tumor progression. Here, we aimed to uncover the role of mutated human KRAS in the regulation of apoptosis and its interaction with mitochondria, specifically with the pro-apoptotic protein BAX, and in the regulation of the glycolytic metabolism, using the yeast Saccharomyces cerevisiae as a model. To achieve our aims, KRAS-humanized yeasts expressing KRASWT or KRAS bearing the hot spot mutations found in CRC, KRASG12D, KRASG12V or KRASG13D, were used, and, to assess the influence of the different KRAS isoforms on BAX activity, these cells were co-transformed with the human BAX. Concerning the regulation of apoptosis, our results showed that KRAS mutations confer resistance to BAX-induced cell death in yeast, compared with KRASWT, which also induces cytochrome c release. To explain the interaction of both proteins, we also demonstrate that BAX and KRAS isoforms co-localize at the mitochondria and physically interact. Remarkably, KRAS mutations increase the susceptibility to acetic acid-induced cell death of cells expressing BAX, in contrast to KRASWT . Regarding the role of mutated KRAS in the metabolic adaptation, our results corroborate that cells harboring KRAS mutations can adapt their cellular metabolism, according to the carbon source available in the extracellular medium. On one hand, in medium containing glucose, they favor fermentation over respiration. On the other hand, in medium containing lactic acid, KRAS mutants favor respiration, also resulting in higher specific growth rates, in comparison with KRASWT. Altogether these findings sustain that oncogenic KRAS mutations favor tumor progression by inducing resistance to BAX-induced cell death as well as by conferring an advantageous ability for metabolic adaptation in tumor microenvironment containing increased lactate.