Engineering phages towards Pseudomonas aeruginosa detection and control

Abstract

A Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa que prospera numa variedade de ambientes. Esta bactéria patogénica é um dos microrganismos mais frequentemente isolados do trato respiratório de pacientes em estado crítico e imunocomprometido. Para além disso, o seu frequente envolvimento numa ampla gama de doenças e a sua baixa suscetibilidade a uma ampla gama de antibióticos, torna P. aeruginosa um sério desafio terapêutico, que muitas vezes resulta em internamentos prolongados, aumento dos custos médicos e altas taxas de mortalidade. Face a isto, o desenvolvimento de abordagens alternativas ao uso destes antimicrobianos é de extrema importância e os bacteriófagos têm um elevado potencial no controlo de doenças bacterianas, mas geralmente exibem um espetro de ação limitado. Através da utilização de ferramentas de engenharia de fagos, é possível produzir fagos quiméricos com características desejáveis de forma a melhorar a deteção e/ou controlo de estirpes bacterianas num contexto clínico. Além disso, os fagos modificados podem codificar vários genes repórter, substituindo assim os métodos de cultura convencionais. O objetivo deste projeto assenta na engenharia do genoma de fagos de P. aeruginosa para melhorar as suas funcionalidades, assim como aumentar o seu espetro de ação para uma ampla gama de bactérias hospedeiras e obter uma ferramenta promissora para o diagnóstico e tratamento de pacientes com infeções resistentes a antibióticos. O primeiro passo deste trabalho consistiu em avaliar o potencial de um fago repórter previamente construído, contendo o gene da NanoLuc luciferase (PE3Δgp1–gp12:Nluc) para detetar células de P. aeruginosa. O limite de deteção deste fago repórter variou entre 620 e 9000 UFC/mL em apenas 7 h, sendo o limite de deteção mais baixo alcançado para a estirpe hospedeira do fago. Posto isto, este sistema de deteção baseado em fago constitui uma alternativa promissora aos métodos de cultura, já que permite um diagnóstico mais rápido. A fim de aumentar o espetro lítico deste fago, foi realizada uma análise genómica para os fagos de Pseudomonas phiIBB-PAA2 e vB_PaeP_PE3. Desta forma, foram identificadas e selecionadas potenciais Tail Fiber Proteins (TFPs). Sete proteínas codificadas nos genomas dos fagos foram selecionadas e de seguida clonadas, expressas e purificadas, mas apenas uma (pGFP_A2gp55) foi capaz de se ligar a células de P. aeruginosa PAO1. Com base nestes ensaios, foi usada uma ferramenta de engenharia de fagos baseada em levedura para inserir com sucesso a TFP funcional (gp55) do fago A2 no genoma do fago PE3Δgp1–gp12:Nluc. Ainda assim, este método não permitiu aumentar o espetro de hospedeiros do fago.

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative bacterium that thrives in a variety of environments. This bacterial pathogen is one of the most common microrganims frequently isolated from the respiratory tract of critically ill and immunocompromised pacients. In addition, its frequent involvement in a wide range of illnesses and its low susceptibility to a wide range of antibiotics, makes P. aeruginosa a serious therapeutic challenge, which often results in prolonged hospital stays, increased medical costs, and high mortality rates. Given this, the development of alternative approaches to the use of these antimicrobials is extremely important and bacteriophages have a tremendous potential against bacterial diseases but they usually exhibit a limited host range. Taking advantage of phage-engineering tools, it is possible to assemble chimeric phages with desirable features in order to improve the detection and/or control bacterial strains in clinical settings. In addition, engineered phages can encode numerous reporter genes, therefore replacing the conventional culture methods. The aim of this project relies on engineering the genome of P. aeruginosa phages to improve its performance by expanding their host range, in order to get a promising tool for the diagnosis and treatment of patients with antibiotic-resistant infections. This research's initial step was to evaluate how well a previously built reporter phage (PE3gp1-gp12:Nluc) could identify P. aeruginosa cells. The lowest detection limit for the phage host strain P. aeruginosa PAO1 was reached by this reporter phage, whose detection limit ranged from 620 to 9000 CFU/mL in only 7 hours. Nevertheless, because it enables quicker diagnosis, this phage-based detection technology is a possible replacement for culture approaches. To increase the host range of this phage, a genomic analysis was performed for the Pseudomonas phages phiIBB-PAA2 and vB_PaeP_PE3. This method allowed for the identification and selection of prospective Tail Fiber Proteins (TFPs). Seven selected proteins encoded in phage genomes were then cloned, expressed and purified, but only one (pGFP_A2gp55) was capable of binding to P. aeruginosa PAO1 cells. Based on these assays, the yeast-based phage-engineering tool was used to successfully insert the functional TFP (gp55) from A2 phage on PE3Δgp1–gp12:Nluc phage genome. However, this approach was unable to broaden the range of phage hosts.