Development of fast methods for the detection of patulin producing fungi

Abstract

Micotoxinas são metabolitos fúngicos secundários que podem ser tóxicos para humanos, animais e plantas. Algumas das micotoxinas mais observadas são ocratoxina A (OTA), aflatoxinas, fumonisinas e patulina (PAT), que representam uma preocupação para a saúde humana e pecuária. Membros dos três géneros de fungos: Aspergillus, Fusarium e Penicillium são os principais produtores de micotoxinas, sendo Penicillium expansum o principal produtor de PAT. As culturas podem ser infetadas antes ou depois da colheita, resultando na contaminação da cadeia alimentar. Existem alguns efeitos adversos das micotoxinas para a saúde, como a toxicidade aguda, resultando na deterioração das funções hepáticas ou renais e imunodeficiência. Deste modo, o potencial das micotoxinas em prejudicar a saúde através da exposição às mesmas, conduziu ao desenvolvimento de métodos que detetam fungos produtores de micotoxinas. Os métodos tradicionais são baseados em técnicas de cultura que consomem muito tempo e que requerem grandes quantidades de meios e reagentes. Devido a estas limitações, há um interesse crescente em métodos mais rápidos e sensíveis para a deteção dos principais contaminantes dos alimentos. Neste sentido, técnicas moleculares de DNA têm sido utilizadas como um método alternativo devido ao menor tempo de análise e maior sensibilidade. Alguns exemplos são a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), o PCR em Tempo Real (qPCR) e a Amplificação da Polimerase de Recombinação (RPA). A RPA é uma técnica de amplificação isotérmica que apresenta grandes vantagens como a sensibilidade, o baixo custo de operação, temperatura baixa constante e não requer instrumentos complexos. Uma forma de detetar os produtos de amplificação da reação de RPA são as Fitas de Fluxo Lateral (LFS) – dispositivos simples para a deteção de analitos onde os resultados podem ser observados diretamente a olho nu dentro de 5 a 15 minutos. O analito de interesse é capaz de se mover por ação capilar através das várias secções da fita, onde estão ligadas moléculas que podem interagir com o analito. Na presente tese foi desenvolvida uma combinação do método RPA com o LFS para a deteção a olho nu de fungos produtores de PAT, utilizando um conjunto de primers e uma sonda que têm como alvo o gene isoepoxydon dehydrogenase (idh). Esta combinação foi bem-sucedida para todas as estirpes de P. expansum.

Mycotoxins are secondary fungal metabolites that can be toxic to humans, animals and plants. Some of the most commonly observed mycotoxins are ochratoxin A (OTA), aflatoxins, fumonisins and patulin (PAT), which present a concern to human health and livestock. Members of three fungal genera: Aspergillus, Fusarium and Penicillium are the mainly producers of mycotoxins, where Penicillium expansum is the main producer of PAT. Crops can be infected before or after harvesting, resulting in contamination in the food chain. There are some adverse health effects of mycotoxins, such as acute toxicity, resulting in deterioration of the liver or kidney function and immunodeficiency. Thereby, the potential of mycotoxins to cause harm health through exposure has led to the development of methods that detect mycotoxins producing fungi. Traditional methods are culture-based techniques which are time consuming and require huge amounts of media and reagents. Because of these limitations, there is an increasing interest in faster and more sensitive methods for the detection of major food contaminants. In these sense, DNA molecular techniques have been used as an alternative method owing to their lower analysis time and higher sensitivity. Some examples are Polymerase Chain Reaction (PCR), Real-time PCR (qPCR) and Recombinase Polymerase Amplification (RPA). RPA is an isothermal amplification technique that has great advantages such as its sensitivity, its operation low cost, constant low temperature and it does not require complex instruments. A way to detect the amplification products of the RPA reactions is the Lateral Flow Strips (LFS) – simple devices for the detection of analytes where the results can be directly observable by naked-eye within 5 to 15 minutes. The analyte of interest is able to move by capillary action through the various sections of the strip, where attached molecules can interact with the analyte. In the present thesis it was developed a combination of the RPA method with the LFS for the naked-eye detection of PAT producing molds, using a set of primers and probe that target the isoepoxydon dehydrogenase (idh) gene. This combination was successful for all the P. expansum strains.