Exploring the role of Vav3 in the repair of toxin-induced plasma membrane damage

Abstract

A saúde e o bem-estar de uma célula dependem diretamente da integridade da sua membrana plasmática (PM) e da sua capacidade em repará-la após eventos de rutura que ameaçam as células individuais e organismos multicelulares induzindo a morte celular e a inflamação dos tecidos. As bactérias patogénicas produzem e secretam poderosos fatores de virulência, como toxinas formadoras de poros (PFTs) que, uma vez secretadas pela bactéria, difundem-se em direção à célula-alvo, à qual se ligam por meio de um recetor específico formando poros na PM. As proteínas do citoesqueleto e da matriz extracelular são responsáveis por conferir resistência aos danos da PM. Além disso, as proteínas do citoesqueleto modulam as propriedades intrínsecas da PM conferindo resistência às lesões, representando, assim, um mecanismo preventivo contra danos da membrana. A listeriolisina O (LLO) é uma toxina formadora de poros dependente do colesterol, produzida pela Listeria monocytogenes, um patógeno bacteriano oportunista responsável pela doença listeriose. Esta doença começa com a ingestão de alimentos contaminados e afeta principalmente indivíduos imunocomprometidos, idosos, recém-nascidos e grávidas. Esta dissertação foca-se no papel da Vav3, um regulador da dinâmica do citoesqueleto, nos mecanismos de reparação de danos da PM induzidos por toxinas. Para isso, células epiteliais humanas a expressar diferentes níveis de Vav3 foram intoxicadas com LLO purificada e os processos de dano e reparação foram avaliados por ensaios de permeabilização das células com iodeto de propídio. Além disso, as alterações na expressão de vav3 após a intoxicação por LLO foram avaliadas por RT-qPCR. Os dados mostram que a sobrexpressão de Vav3 não representa uma vantagem durante a intoxicação com concentrações sub-líticas de LLO e as células não aumentam a expressão de vav3 após a intoxicação por LLO. No entanto, os resultados sugerem um possível papel para Vav3 em resposta a concentrações líticas de LLO. Essas observações precisam de ser exploradas sob uma forma experimental mais complexa, que é proposta aqui.

Health and well-being of a cell critically depend on the integrity of its plasma membrane (PM) and its ability to repair itself upon critical PM disruption events that threat individual cells and multicellular organisms, inducing cell death and tissue inflammation. Pathogenic bacteria produce and secrete powerful virulence factors, such as pore forming toxins (PFTs) that once secreted by the bacteria, diffuse towards their target cell, to which they bind via a specific receptor forming PM pores. Proteins from the cytoskeleton and the extracellular matrix are main actors conferring resistance to the PM damage. In addition, cytoskeletal proteins modulate the intrinsic properties of the PM to confer resistance to wounds, thus representing a preventive mechanism against membrane injuries. Listeriolysin O (LLO) is a cholesterol-dependent pore-forming toxin produced by Listeria monocytogenes, an opportunistic bacterial pathogen responsible for the disease listeriosis. This disease starts with the ingestion of contaminated foods and mainly affects immunocompromised individuals, elderly, newborns, and pregnant women. This dissertation concentrates on the role of Vav3, a master regulator of cytoskeletal dynamics, in the repair mechanisms of toxin-induced PM damage. For this, human epithelial cells expressing different levels of Vav3 were intoxicated with purified LLO and the damage and repair processes were evaluated by propidium iodide permeabilization assays. In addition, changes in vav3 expression upon LLO intoxication were assessed by RT-qPCR. Data show that Vav3 overexpression does not represent an advantage during intoxication with sub-lytic concentrations of LLO and cells do not increase vav3 expression upon LLO intoxication. However, the results suggest a possible role for Vav3 in response to lytic concentrations of LLO. These observations need to be further explored under a more complex experimental setup, which is proposed here.