Role of TET3 enzyme in brain function

Abstract

A familia de enzimas “Ten Eleven Translocation” (TET) consiste em três dioxigenases envolvidadas na desmetilação do DNA, convertendo 5-metilcitosina (5-mC) em 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5- formilcitosina (5fC) e 5-carboxilcitosina (5caC). Níveis elevados de 5hmC estão correlacionados positivamente com a transcrição de genes, e são característicos de neurónios pós-mitóticos. Os genes Tet são altamente expressos no cérebro, sendo o Tet3 o mais abundante. Nesta tese demonstramos que os níveis de expressão de Tet3 aumentam durante a diferenciação neuronal. Além disso, usando um sistema de diferenciação in vitro, onde células estaminais embrionárias (ESC) podem ser diferenciadas numa população homogénea de percursores de células neurais (NPCs), verificamos que a Tet3 é essencial para manter o silenciamento de genes de pluripotência nos NPCs. O descréscimo de expressão de Tet3 (KD), induzido pela técnica de RNA de interferência (RNAi), em NPCs, resultou num aumento da expressão dos genes de pluripotência Oct4 e Nanog, com células positivas para OCT4 formando agregados celulares. Adicionalmente, o KD de Tet3 desencadeou uma perda global de metilação no DNA e hiper-metilação de alguns genes relacionados com a neurogénese e regiões controlo de genes “imprinted”. Mais, analisamos o impacto da deleção de Tet3 nos neurónos pós-mitóticos usando um modelo onde a Tet3 é deletada especificamente em células positivas para Camk2a, após administração de tamoxifeno. Caracterizamos o efeito a nível comportamental em ratinhos jovens adultos, machos e fêmeas; demonstrando que a deleção da Tet3 conduz a um aumento do comportamento do tipo ansioso e induz défices cognitivos, nomeadamente na orientação espacial. Demonstramos que nos machos, mas não nas fêmeas, existe um aumento dos níveis de corticosterona e aumento da maturação das espinhas na região ventral hipocampal,CA1. Contrariamente aos machos que não demonstraram qualquer dano na memória a curto prazo, as fêmeas Tet3 cKO apresentaram. Em ambos os géneros, observamos uma expressão aumentada de Npas4 e c-fos no hipocampo. Assim, nesta tese, propomos que a enzima TET3 tem um papel fulcral na manutenção da identidade das células precursoras neurais e funciona como um regulador epigenético no comportamento do tipo ansioso e na orientação espacial.

The Ten eleven translocation (TET) family of enzymes consists of three dioxygenases involved in the DNA demethylation process; they convert 5-methylcytosine base (5mC) into 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC). High 5hmC content is positively correlated with gene transcription and is a feature of post-mitotic neurons. Tet genes have also been shown to be highly transcribed in the brain, with Tet3 being the most abundant. Here we showed that Tet3 is highly upregulated during neuronal differentiation. Importantly, using an in vitro differentiation system, where ES cells can be differentiated into a homogeneous population of neural precursor cells (NPCs), we discovered that Tet3 is required to maintain the silencing of pluripotency-associated genes in neural precursor cells (NPCs). Tet3 knockdown (KD) in NPCs led to a significant increase in Oct4 and Nanog gene expression, with OCT4-positive cells forming cellular aggregates. Moreover, Tet3 KD triggered a genome-scale loss of DNA methylation and hypermethylation of a small number of neurogenesis-related genes and at imprinting control regions of imprinted genes. We extended the analyses of Tet3 deletion impact to post-mitotic neurons using a conditional and inducible mouse model where Tet3 is deleted specifically in Camk2a-positive cells after tamoxifen administration. We characterized the impact of Tet3 deletion on behavior performance in young adult mice, males and females; the absence of Tet3 led to an increase in anxiety-like behavior and cognitive impairment, namely spatial orientation, in female and male mice. The Tet3 cKO males showed increased corticosterone levels and increased dendritic spine maturation in the ventral CA1 hippocampal subregion, which was not observed in females. Also, contrary to the results in males, Tet3 cKO female mice presented impairment in short-term memory. In both genders, we observed an increase in Npas4 and c-fos gene expression in the hippocampus. Thus, in this thesis, we propose that TET3 plays a pivotal role in maintaining neural precursor cell identity and DNA methylation levels, and has an important function as an epigenetic regulator of anxiety-like behavior and spatial orientation.