Unveiling the integration of redox and bioelectric phenomena in vertebrate regeneration

Abstract

Regeneração, ou a capacidade de recuperar a forma e função em caso de lesão em larga escala, é um processo complexo. Múltiplas vias bioquímicas e biofísicas têm vindo a ser reveladas como importantes para a regeneração epimórfica. Entre elas, as espécies reativas de oxigénio (ROS) e a densidade de corrente elétrica (JI) modulam a regeneração. No entanto, a relação entre os sinais bioquímicos e biofísicos durante a regeneração permanece evasiva. Aqui, investiga-se a interação entre os estados redox (parte bioquímica) e bioelétrico (parte biofísica) na regeneração caudal de girinos Xenopus laevis. Uma regulação de duas vias das atividades bioelétricas pelos ROS é revelada. O fluxo de eletrões conduzido pelas NADPH oxidases (propriedade eletrogénica) despolariza o potencial de membrana (Vm), enquanto os ROS (propriedade catalítica) aumentam o potencial transepitelial (TEP) e revertem a JI durante a regeneração. A depleção dos ROS por inibição da produção, eliminação ou bloqueio da sua difusão para o interior das células, mimetiza os TEP e JI anormais do período refratário (não regenerativo). Crucialmente, a aplicação breve de peróxido de hidrogénio (H2O2) recupera (do decréscimo de ROS) e induz (do período refratário) regeneração, aumento do TEP e reversão do JI. Assim, H2O2 é necessário à e suficiente para induzir a regeneração e para regular os TEP e JI. Ensaios de epistasia mostram que os canais de Na+ dependente de voltagem (NaV) atuam a jusante de H2O2. Um micro-ótrodo detalhado é usado para traçar o perfil espácio-temporal de fluxo de O2 durante a regeneração. O perfil revela um aumento no influxo de O2, após amputação, que se correlaciona com a regeneração. A inibição da produção de ROS, mas não a sua eliminação, diminui a magnitude do influxo. Assim, a produção de ROS é responsável pela maior parte da força motriz que impulsiona o O2. Tanto o O2 como os ROS contribuem para a pressão parcial de O2, afetando a hipóxia e consequente estabilização do fator induzível pela hipóxia (HIF). Notavelmente, o bloqueio de HIF-1α impede a regeneração, enquanto a sua estabilização induz a regeneração no período refratário. A proteína de choque térmico (HSP) 90 é um potencial e a reversão do JI é um de facto alvo a jusante de HIF-1α. Em conjunto, estes resultados revelam a orquestração de atividades redox e bioelétricas e integram-nas durante a regeneração de um vertebrado. Estas descobertas poderão ser importantes para induzir a regeneração epimórfica no corpo humano, provavelmente a derradeira meta da medicina regenerativa.

Regeneration, or the ability to regain the form and function upon large-scale injury, is a complex process. Multiple biochemical and biophysical pathways and cues play a key role during epimorphic regeneration. Among them, reactive oxygen species (ROS) and electric current densities (JI) modulate regeneration. However, the biochemical and biophysical crosstalk during regeneration remains elusive. Here, it is investigated the interplay between redox (biochemical part) and bioelectric (biophysical part) states during tail regeneration in Xenopus laevis tadpoles. A two-way regulation of bioelectric activities by the required NADPH oxidase-mediated production of ROS is unveiled. NADPH oxidase-driven electron flow (electrogenic property) depolarizes the membrane potential (Vm), while produced ROS (catalytic property) increases the transepithelial potential (TEP) and reverses JI during regeneration. Importantly, depletion of ROS levels by the inhibition of production, scavenging or blocking their diffusion into cells, mimics the abnormal TEP and JI observed in the refractory (non-regenerative) period. Crucially, short-term application of hydrogen peroxide (H2O2) rescues (from depleted ROS) and induces (from the refractory period) regeneration, TEP increase and JI reversal. Therefore, H2O2 is necessary for and sufficient to induce regeneration and to regulate TEP and JI. Epistasis assays show that voltage-gated Na+ channels (NaV) act downstream of H2O2. The stringently detailed micro-optrode is used to map the spatiotemporal oxygen (O2) flux during regeneration. The profile reveals an increased and steady O2 influx (an O2 sink) immediately upon amputation that correlates with regeneration. Inhibition of ROS production, but not their scavenging, decreases the magnitude of O2 influx. Therefore, ROS production accounts for most of the motive force driving O2 flux. Both O2 and ROS contribute to the local partial pressure of O2, affecting hypoxia and consequent hypoxia-inducible factor (HIF) stabilization in the regeneration bud. Notably, blocking HIF-1α abrogates regeneration, while stabilizing its activity induces regeneration in the refractory period. Heat shock protein (HSP) 90 is a potential and JI reversal is a de facto downstream target of HIF-1α activity. Altogether, these results unveil the orchestration of redox and bioelectric activities and integrate them during a vertebrate model of regeneration. These discoveries might be important to induce epimorphic regeneration in the human body, probably the ultimate goal of regenerative medicine.