Development of an aptamer-based nanoparticle towards breast cancer

Abstract

Breast cancer is a heterogeneous and complex disease which incidence is increasing. Diagnosis of breast cancer evolved in the past from morphological observation to mammography. Immunopathological and high-throughput methods are recent methods that allow distinguishing different breast cancer types. The biomarkers used for diagnosis include estrogen receptor, progesterone receptor and human epidermal growth factor receptor 2. Triple negative breast cancer lacks the expression of both ER and PR, as well as the over-expression and/or lack of the HER2 gene amplification. TNBCs diagnosis and therapy are challenging due to lack of known receptors. However, many efforts are being developed to overcome these hurdles. One of those include the use of aptamers that are single-stranded oligonucleotides able to bind various molecular targets with high affinity and specificity and in some cases able to penetrate tumours. Hence, it is possible to develop aptamers that specifically recognize tumour cell receptors. The main aim of this work was to develop an aptamer-nanoparticle complex for TNBC early diagnosis. In the current project, the secondary structure of two previously selected aptamers by Cell-SELEX, aptamer #1 and aptamer #2, were predicted using Mfold, which suggested the formation of a hairpin at 4 ºC and 37 ºC. Then, the binding ability of these aptamers was assessed by flow cytometry and microscopy, revealing that aptamer #1 and aptamer #2 specifically bound to MDA-MB-231 and not to MCF-10-2A cells. Furthermore, the dissociation constants of both aptamers were calculated, aptamer #1 KD = 82.29 ± 13.64 nM and aptamer #2 KD was 54.63 ± 18.87 nM. Aptamer #2 KD was found to be lower, although the differences are not statistically significant. The cytotoxic assay indicated that the aptamers affected MDA-MB-231 cells, although the morphological assay pointed in a different direction. Moreover, amine labeled aptamer was used to functionalize green fluorescent silica particles using the carbodiimide chemistry, and the ligation aptamer-particle was evaluated through three diferent methodologies including Dynamic Light Scattering, NanoDrop and gel electophoresis. The functionalization was not successful. However, binding ability assays were performed and suggested that only silica nanoparticles entered the cells, possibly through endocytosis. In addition, the possible targets for these aptamers were ascertain and it was found that 4 possible targets are present in MDA-MB-231. It was shown that the target is present in the cell membrane and in the cytosol. Altough an aptamer-based nanoparticle for diagnostic was not achieved, improvements towards achieving this goal can be done.

O cancro da mama é uma doença heterogénea e complexa cuja incidência está a aumentar. O diagnóstico de cancro da mama evoluiu desde a observação morfológica até à mamografia. Métodos imunopatológicos e de alto rendimento são métodos recentes e permitem distinguir diferentes tipos de cancro da mama. Os biomarcadores utilizados para o diagnóstico incluem recetor de estrogénio, recetor de progesterona e recetor do fator de crescimento epidérmico humano 2. O cancro da mama triplo negativo não possui a expressão de recetores de estrogénio e progesterona, assim como a sobreexpressão e / ou falta de amplificação do gene recetor do fator de crescimento epidérmico humano 2, tornando o diagnóstico e a terapia desafiantes, sendo feitos muitos esforços nesse sentido. Um deles inclui o uso de aptamers que são oligonucleotídeos de cadeia simples capazes de se ligar a vários alvos moleculares com alta afinidade e especificidade e, em alguns casos, capazes de penetrar em tumores. Assim, é possível desenvolver aptamers que reconhecem especificamente recetores de células tumorais. O principal objetivo deste trabalho foi desenvolver um complexo aptamers-nanopartícula para o diagnóstico precoce do cancro da mama triplo negativo. Neste projeto, a estrutura secundária de aptamer # 1 e aptamer # 2 previamente selecionados por Cell-SELEX foi prevista usando Mfold, o que sugeriu a formação de um hairpin a 4 ºC e 37 ºC. Em seguida, a capacidade de ligação destes aptamers foi avaliada por citometria de fluxo e microscopia, revelando que os aptamers # 1 e # 2 ligaram-se especificamente a MDA-MB-231 e não a MCF-10-2A. Além disso, as constantes de dissociação de ambos os aptamers foram calculadas: aptamer # 1 KD = 82,29 ± 13,64 nM e aptamer # 2 KD foi 54,63 ± 18,87 nM. A KD # 2 é menor que a KD # 1, embora a diferença não seja estatisticamente significativa. O ensaio citotóxico indicou que os aptamers afetavam as células MDA-MB-231, embora o ensaio morfológico apontasse em uma direção diferente. Além disso, o aptamer marcado com amina foi utilizado para funcionalizar nanopartículas de sílica fluorescentes através da química da carbodiimida; a ligação de partículas de aptamers foi avaliada através de três metodologias diferentes, incluindo Dynamic Light Scattering, NanoDrop e eletroforese em gel. A funcionalização não foi bem sucedida. Os ensaios de capacidade de ligação foram realizados e sugeriram que as nanopartículas de sílica entraram nas células, possivelmente através de endocitose. Encontraram-se 4 alvos possíveis presentes em MDA-MB-231. Foi demonstrado que o alvo está presente na membrana celular e no citosol. Embora uma nanopartícula dirigida para diagnóstico não tenha sido obtida, melhorias para atingir essa meta podem ser feitas.