Biotechnological processes for D-tagatose production

Abstract

Society growing awareness of excessive sugar consumption impact in health has led to an increased attention towards several sugar substitutes. Despite the existing alternatives in the market, D-tagatose possesses unique features. The enzymatic isomerization of D-galactose has achieved more projection as it is a more environmentally friendly compared to chemical isomerization. On the other hand, the search of renewable sources of D-galactose is necessary to attain a sustainable growth. Nevertheless, D-galactose production from renewable resources requires a pre-treatment that includes a hydrolysis of polysaccharides or disaccharides to obtain monomer sugars. Thus, the main objective of this thesis was the production of D-tagatose from several renewable resources by enzymatic isomerization of D-galactose using a L-arabinose isomerase from Bacillus subtilis (BSAI). For that, production and purification of BSAI enzyme was performed. Moreover, Gelidium amansii, κ-carrageenan and cheese whey were evaluated as sources of D-galactose by acid and enzymatic hydrolysis of complex sugars. BSAI was produced and purified with a yield of 34 mg/g cell. Moreover, isomerase activity for D-galactose substrate was verified by HPLC (High performance liquid chromatography). The BSAI enzyme was used for D-tagatose production from D-galactose obtained from several raw materials. Regards, red seaweed pre-treatment for D-galactose production, 12% (w/w) of biomass using a ratio of 0.125 g of sulphuric acid/g at 150 ºC for 10 min was suitable for the extraction of galactan as galactose achieving a concentration of 22.28 g/L. On other hand, optimization of hydrolysis of κ-carrageenan was performed by an experimental design. Under selected conditions (sulphuric acid concentration of 2.25% (w/w) and a treatment time of 45 minutes), percentage of hydrocolloid was increased to 8% (w/w) in order to obtain a liquor with approximately 20 g/L of D-galactose. Finally, cheese whey powder was enzymatically hydrolysed using a lactase (5UI/g of lactose) achieving 26.67 g/L of D-galactose. For liquors from Gelidium amansii there are no significant differences in the conversion between the use of detoxified and non-detoxified liquors. So, HMF did not inhibited the action of the BSAI enzyme. For the same BSAI concentration (7 mg/mL) conversions of 50.9, 52.0, 55.6 and 27.8% were obtained in the isomerization assays with Gelidium amansii detoxified and non-detoxified liquor, cheese whey hydrolysate and κ-carrageenan hydrolysate, respectively. The results obtained are very similar to those obtained in the group previously with pure galactose solutions. Thus, the use of liquors instead of pure solutions does not affect BSAI enzyme activity.

crescente consciencialização da sociedade sobre o impacto do consumo excessivo de açúcar na saúde levou a uma atenção crescente para vários substitutos do açúcar. Apesar das alternativas existentes no mercado, D-tagatose possui características únicas. A isomerização enzimática de D-galactose alcançou mais projeção, uma vez que é menos prejudicial para o ambiente quando comparada com a isomerização química. Por outro lado, a busca de fontes renováveis de D-galactose é necessária para alcançar um crescimento sustentável. No entanto, a produção de D-galactose a partir de recursos renováveis requer um pré-tratamento que resulte na hidrólise de polissacarídeos ou dissacarídeos para obter monómeros de açúcares. Assim, o principal objetivo desta tese foi a produção de D-tagatose a partir de vários recursos renováveis através da isomerização enzimática de D-galactose, utilizando a L-arabinose isomerase de Bacillus subtilis (BSAI). Para isso, foi realizada a produção e purificação da enzima BSAI. Além disso, Gelidium amansii, κ-carragenano e o soro de queijo foram avaliados como fontes de D-galactose por hidrólise ácida e enzimática de açúcares complexos. A enzima BSAI foi produzida e purificada com um rendimento de 34 mg/g de células e a sua atividade para o substrato D-galactose foi verificada por HPLC (High performance liquid chromatography). A enzima BSAI foi utilizada para a produção de D-tagatose a partir de D-galactose obtida a partir de várias matérias primas. O pré-tratamento de Gelidium amansii foi adequado atingindo uma concentração de 22,28 g/L de D-galactose, com 12% (p/p) de biomassa utilizando uma proporção de 0,125 g de ácido sulfúrico/g a 150 ºC durante 10 min. Por outro lado, a otimização da hidrólise do κ-carragenano foi realizada por um desenho experimental. Sob condições selecionadas (concentração de ácido sulfúrico de 2,25% (p/p) e tempo de tratamento de 45 minutos), a percentagem do sólido foi aumentada para 8% (p/p), a fim de obter um licor com aproximadamente 20 g/L de D-galactose. Finalmente, o soro de queijo foi hidrolisado enzimaticamente usando uma lactase (5UI/g de lactose) atingindo 26,67 g/L de D-galactose. Utilizando os licores de Gelidium amansii, destoxificado e o não destoxificado, não se verificaram diferenças significativas na conversão. Assim, o HMF não inibiu a ação da enzima BSAI. Para a mesma concentração de BSAI (7 mg/mL), conversões de 50,9; 52,0; 55,6 e 27,8% foram obtidas nos ensaios de isomerização com o licor destoxificado e não destoxificado (Gelidium amansii), o hidrolisado do soro de queijo e o hidrolisado de κ-carragenano, respetivamente. Os resultados obtidos são muito semelhantes aos obtidos no grupo anteriormente com soluções puras de D-galactose. Assim, o uso de licores em vez de soluções puras não afeta a atividade da enzima BSAI.