Assembly of granulomas during mycobacterial infections in mice: cellular and molecular dynamics

Abstract

Granulomas are organized accumulations of inflammatory cells typically found during mycobacterial infections. Although for a long time believed to confer protection to an infected host, recent evidence has challenged this idea, and raises the possibility that granulomas may provide a sanctuary for the microbe by facilitating its proliferation in the infected animal. Thus it is essential to understand the genesis of this inflammation type and elucidate its role in the development of protective immunity. Here we dissect the dynamics of granuloma formation and its impact in the development of protective immunity during distinct phases of the immune response to mycobacterial infections: from the early innate mechanisms behind granuloma initiation, through the adaptive immunity and its action on macrophages necessary for granuloma development, to the final steps leading to granuloma necrosis. IFN-γ is directly implicated in the most important microbicidal mechanisms, playing a central role during both innate and adaptive immune response against mycobacteria. This cytokine, also known to be required for granuloma development, is mostly produced by NK cells during the innate immune response and by T cells at the onset of the adaptive immunity. However, evidence from animal models lacking adaptive immunity suggests the involvement of a non-NK innate cell source of IFN-γ required for resistance to mycobacteria. We have identified a rare population of IFN-γ -expressing CD45+ Thy1.2+ cells that are independent of the common-γ chain of the IL-2 receptor and are of a nonlymphoid, nonmyeloid and non-NK lineage. Moreover we provide evidence that these cells localize within the mycobacterial granuloma and can provide partial protection to Mycobacterium avium infected-immunocompromised mice. We have further explored the role of IFN-γ on the onset of the adaptive immunity. The impact of IFN-γ has been widely attributed to its action on macrophages, particularly in the context of pathogens like mycobacteria which have this cell as their main target. We used the MIIG mouse model, whose macrophages are unresponsive to IFN-γ to explore the specific relevance of the IFN-γ-mediated macrophage activation in vivo. We confirmed the requirement of IFN-γ inducing resistance to M. avium infection and observed the unexpected result that macrophage activation by this cytokine is not pivotal for such protective immunity or for granuloma development. Additionally we found that TNF-α may compensate for the lack of IFN-γ-signaling on macrophages, thus contributing for the resistance to M. avium infection. Granuloma central necrosis is associated with more severe forms of mycobacterial infection since it compromises tissue integrity and can facilitate bacterial spread. In a previous work from our lab we have provided evidence that granulomas become hypoxic before the onset of the necrotic process and that the hypoxia adaptor molecule HIF-1α plays a central role in preventing the earlier development of liver granuloma necrosis in a M. avium infection context. Here we assessed how the transcription factor HIF-1α may impact granuloma development in the lungs of Mycobacterium tuberculosis (Mtb)-infected C57BL/6 mice. Our data suggests that while Mtb infected mice do not develop granuloma necrosis in the lung, HIF-1α is absolutely required to limit the pulmonary inflammatory response. In summary, the findings presented in this thesis contribute to a better understanding of the mechanisms behind granuloma development and the protective immunity to mycobacterial infections. We provide novel data that may be useful to delineate new approaches to cope with mycobacterial infection.

Os granulomas são estruturas constituídas por acumulações de células inflamatórias que se desenvolvem durante a resposta a infecções por micobactérias. Apesar de, durante muito tempo se acreditar que estas estruturas conferem protecção ao hospedeiro, recentemente surgiram evidências que desafiam esta ideia, colocando em hipótese que os granulomas possam funcionar como um santuário para as bactérias facilitando a sua proliferação no animal infectado. Assim, é essencial comprender a génese deste tipo de inflamação e elucidar o seu papel no desenvolvimento da imunidade protectora. Nesta tese dissecamos a dinâmica de formação do granuloma e o seu impacto no desenvolvimento da imunidade protectora ao longo de diferentes fases da resposta imune a infecções micobacterianas: começando pelos mecanismo inatos que estão por trás da formação inicial do granuloma, passando pelo imapcto da resposta adaptativa na activação dos macrófagos e desenvolvimento do granuloma, até aos processos finais que podem levar à necrose central do granuloma. O IFN-γ está directamente implicado na activação dos mecanismos microbicidas mais importantes da célula, desempenhando um papel fundamental tanto durante a resposta inata como na resposta adaptativa contra a infecção por micobactérias. Esta citoquina, que também é requerida para o desenvolvimento do granuloma, é maioritariamente produzida por células NK durante a imunidade inata e por células T durante a imunidade adaptativa. No entanto, a partir de modelos animais que não têm imunidade adaptativa, têm surgido evidências do envolvimento de uma fonte celular inata produtora de IFN-γ, que não as células NK, necessárias na resistência à micobactéria. De facto, nós identificamos uma população rara de células CD45+ Thy1.2+ capazes de expressar IFN-γ e que são independentes da cadeia γ pertencendo a uma linhagem de céluas não-linfoide, não-mieloide e não-NK. Além disso, mostramos eviências de que estas células se localizam no granuloma micobacteriano e proporcionam um protecção parcial em murganhos imunocomprometidos infectados com Mycobacterium avium. Nesta tese também aprofundamos o estudo do papel do IFN-γ durante a imunidade inata. O impacto do IFN-γ tem sido na generalidade atribuído à sua acção sob os macrófagos, particularmente na resposta a patogénios como a micobactéria que têm esta célula como principal alvo. Para explorar, in vivo, a relevância da activação específica do macrófago mediada pelo IFN-γ, usamos o modelo de murganho MIIG cujos os macrófagos não respondem ao IFN-γ. Confirmamos assim que o IFN-γ é necessário para a indução de resistência à infecção por M. avium e mostramos, inesperadamente, que a activação dos macrófagos por esta citoquina não é essencial para a imunidade protectora nem para o desenvolvimento do granuloma. Além disso, mostramos também que o TNF-α pode compensar a ausência da sinalização do IFN-γ no macrófago, contribuindo assim para a resistência à infecção com M. avium. A necrose central nos granulomas está associada a formas mais severas da infecção micobacteriana uma vez que compromete a integridade do tecido, podendo facilitar a disseminação da bactéria. Num trabalho prévio do nosso grupo, mostramos evidências que os granulomas se tornam hipóxicos antes do início do processo necrótico, e que a molécula adaptadora à hipóxia HIF-1α desempenha um papel importante na prevenção do desenvolvimento da necrose em granulomas do fígado numa infecção por M. avium. Nesta tese, mostramos como é que o factor de transcrição HIF-1α pode afectar o desenvolvimento do granuloma em pulmões de murganhos C57BL/6 infectados com Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Os nosso resultados sugerem que, embora os murganhos infectados com Mtb não desenvolvam necrose nos granulomas, o HIF-1α é necessário para limitar uma resposta inflamatória excessiva nos pulmões. Em conclusão, os resultados apresentados nesta tese contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos adjacentes ao desenvolvimento do granulomas e à resposta imune protectora contra infecções por micobactérias. Adicionamos assim novos dados que poderão ser utéis no desenho de novas estratégias para lidar com a infeccção por micobactérias.