Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1822/60473

TitleValidation of siRNAs against MAP2K1/MEK1 towards colon cancer therapy
Author(s)Carvalho, Ana Luísa Afonso de
Advisor(s)Rodrigues, L. R.
KeywordssiRNA
MAPK
MEK1
Gene silencing
Colon cancer
Silenciamento de genes
Cancro do cólon
Issue date2018
Abstract(s)Cancer can be considered a public health problem due to their high incidence and mortality rates. Specifically, colon cancer is the fourth most common and the second deadliest worldwide. The major part of colon cancers occurs due to a family predisposition although some of them can also be related with environmental factors such as smoke, alcohol consumption and a diet rich on fat. Colon cancer therapies depend on the disease stage and rely mostly on surgery and chemotherapy, either adjuvant or neoadjuvant. However, chemotherapy has a few shortcomings as immunosuppression and lack of specificity for instance. Therefore, more specific therapies are need. The use of siRNAs is one of these possibilities since they are able to target specific genes that are often overexpressed on cancer cells. The MAPK pathway plays an important role on cell proliferation, differentiation and apoptosis in mammalian cells. The aberrant activation of this pathway and of MEK1, specifically, is often observed in cancer. So, the goal of this work was the validation of a siRNA targeting MEK1 gene towards colon cancer therapy. MEK1 gene is overexpressed in several colorectal cancer cell lines. Our results showed that the colon cancer cell line with higher expression of MEK1 gene is RKO, so this was the cell line that we used further in the study. RKO cells were transfected with an optimized siRNA concentration of 30 nM and the MEK1 gene knockdown effects on cell cycle and cell proliferation were studied. Moreover, the siRNA transfection efficiency was also evaluated through Western Blot and qRT-PCR. Additionally, it has been reported that MEK1 gene knockdown often leads to a cell cycle arrest on GO-G1 phase. Our results corroborate these reports as a cell cycle arrest on GO-G1 phase was observed, indicating a probable decrease on cell proliferation since the cells do not progress to the S phase. Therefore, SRB and MTS proliferation assays were performed. Although the SRB results were inconclusive, the MTS results confirmed a significant decrease of cell viability on the cells transfected. This could mean that, besides the number of cells remained constant, they may be non-metabolically active. Furthermore, the MEK1_siRNA transfection was considered efficient since it was able to knockdown MEK1 about 52.5% at protein level and about 61.6% at the mRNA level. Additionally, the MEK1 knockdown effect on ERK1 gene, which is located downstream MEK1 gene, was also assessed. Results showed a 52.1% knockdown on the ERK1 gene, thus confirming its effect on cell proliferation. Overall, the results herein gathered are in good agreement with previous reports, thus highlighting the siRNA potential for cancer therapy.
O cancro pode ser considerado um problema de saúde pública tendo em conta as suas taxas de incidência e mortalidade. O cancro do cólon é o quarto cancro mais comum e o segundo mais mortal em todo o mundo. A maioria ocorre devido a uma predisposição familiar, embora alguns estejam relacionados com fatores ambientais tais como o consumo de tabaco e/ou álcool e uma dieta rica em gordura. As terapias usadas dependem do seu estágio e baseiam-se principalmente em cirurgia e quimioterapia. No entanto, a quimioterapia tem desvantagens tais como a imunodepressão ou a falta de especificidade, entre outras. Assim, são necessárias terapias mais especificas. O uso de siRNAs é uma das possibilidades pois estes são capazes de afetar genes específicos que estão muitas vezes sobreexpressos em células cancerígenas. A via de sinalização MAPK tem um papel importante na proliferação, diferenciação e apoptose de células animais. A sua ativação aberrante e em particular do gene MEK1 é muito comum. Assim, o objetivo deste trabalho foi a validação de um siRNA, tendo como alvo o gene MEK1, como potencial terapia do cancro do cólon. O MEK1 é um gene sobre-expresso em várias linhas celulares colorretais. Os resultados demonstraram que a linha celular do cólon com maior expressão de MEK1 é a RKO, tendo, portanto, o restante estudo sido baseado nesta linha celular. As células RKO foram transfectadas com uma concentração otimizada de 30 nM de siRNA e o efeito do silenciamento do MEK1 no ciclo celular e na proliferação celular foi estudado. Adicionalmente, a eficiência da transfecção também foi avaliada através de Western Blot e qRT-PCR. A paragem do ciclo celular na fase G0-G1 como resultado do silenciamento do gene MEK1 tem sido reportado. Os nossos resultados corroboram esses relatos tendo-se observado uma paragem do ciclo em G0-G1, o que indica uma provável diminuição da proliferação celular. Assim, foram realizados os testes SRB e MTS. Os resultados de SRB foram inconclusivos, mas os resultados de MTS demonstraram uma significativa diminuição da viabilidade celular das células transfectadas. Isto pode significar que, apesar do número de células ter sido constante, as mesmas podem não estar metabolicamente ativas. Para além disso, a transfecção de MEK1_siRNA foi considerada eficiente uma vez que silenciou o gene MEK1 em cerca de 52,5% a nível proteico e em cerca de 61,6% a nível do mRNA. Por último, também se avaliou o efeito do silenciamento de MEK1 no gene ERK1, que se encontra localizado abaixo do gene MEK1 na via de sinalização, confirmando, portanto, o seu efeito na proliferação celular. Genericamente, os resultados gerados estão em concordância com estudos anteriores, reforçando o potencial do siRNA para efeitos terapêuticos.
TypeMaster thesis
DescriptionDissertação de mestrado integrado em Engenharia de Biomédica
URIhttp://hdl.handle.net/1822/60473
AccessEmbargoed access (3 Years)
Appears in Collections:CEB - Dissertações de Mestrado / MSc Dissertations
BUM - Dissertações de Mestrado Integrado

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