Characterization of carboxylate transporters: functional and structural studies for the improvement of cell factories

Abstract

As the market demand for sustainable energy increases, production of platform chemicals, such as organic acids, from renewable feedstocks via microbial fermentation has become a more attractive alternative to petroleum-based chemicals. The biosynthesis of organic acids in high and sustainable yields requires the engineering of not only the microorganisms enzymatic and metabolic machinery, but also of plasma membrane transporters. These are able to export organic acids to the extracellular space, improving the host’s tolerance and decreasing downstream processing costs. Thus, to allow a significant impact in future applications envisaging the increase of organic acid production, the study of membrane transporters with specificity for these solutes is of utmost importance. Organic acids are reported to be toxic to cell factories, being associated with trans-membrane potential disruption, cytosol acidification, and anion accumulation. Due to its tolerance to low pH, reducing the need for maintenance of neutral pH and being less vulnerable to contamination, Saccharomyces cerevisiae is taken as one of the most appealing hosts to produce these platform chemicals. In yeasts, the transport of organic acids is played by several membrane proteins, namely the ones belonging to the Jen1 and the Ady2 families. In this study, we functionally characterized Jen1 homologues by heterologous expression in a S. cerevisiae jen1 ady2 strain. We identified an acetate (Dh27), malate (Dh17) and two succinate transporters (Dh18 and Dh24) from the yeast Debaryomyces hansenii. Additionally, we found evidences that saccharate is a substrate of the transporters ScJen1-S271Q and KlJen2, gluconate of CaJen2 and KlJen2, and xylarate and mucate of CaJen2. Organic acid analogues may have therapeutic applications such as 3-Bromopyruvate (3BP) which is reported as an anticancer and antimicrobial drug. We evaluated the role of Jen1 homologues of the human pathogen Cryptococcus neoformans in the transport of 3BP. The Cn04 protein plays an important role in the 3BP uptake and sensitivity of C. neoformans cells. In another approach, several members of the AceTr family were functionally characterized: we show that the YaaH protein from Escherichia coli is a secondary active organic acid/proton symporter, which led to its assignment as SatP, a succinate-acetate transporter; the aceP gene from the archaea Methanosarcina acetivorans was found to be an acetate/proton transporter; and we elucidated the role of Gpr1 from Yarrowia lipolytica as an acetate transport. A phylogenetic analysis of the AceTr family uncovered the presence of homologues in almost all analyzed fungal organisms. Reports about the role of these homologues suggest the importance of these transporters during fungal evolution, associated with sexual reproduction by sporulation. Moreover, we report the essential role of the NPAPLGL(M/S) “signature” motif of this family of transporter, since substitutions in any of the residues of this domain abolished acetate transport. Overall, the present work underlines the wide range of applications of carboxylate transporters in the industrial biotechnology. It also contributed to the deepen the knowledge on microbial carboxylate transporters and provided insights into the evolution, phylogeny and structure of AceTr family members.

À medida que a procura de fontes de energia renováveis aumenta, a produção de compostos químicos por fermentação microbiana, tais como os ácidos orgânicos, torna-se uma alternativa atrativa à síntese química a partir de derivados da indústria petrolífera. A biossíntese de ácidos orgânicos, em concentrações e rendimentos economicamente sustentáveis, requer a manipulação de vias metabólicas e da maquinaria enzimática dos microrganismos, assim como a exploração de transportadores de membrana. Estes são essenciais no efluxo dos ácidos orgânicos para o meio de fermentação, permitindo aumentar a tolerância da célula microbiana em relação a estes compostos e, concomitantemente, diminuir os custos de processamento pós-fermentação. De forma a garantir um progresso significativo em futuras aplicações que visem o aumento de produção de ácidos orgânicos, reveste-se de particular importância aprofundar o conhecimento sobre as proteínas transportadoras destes compostos. Os ácidos orgânicos têm um efeito tóxico nas células, associado à dissipação do potencial transmembranar, acidificação do citosol e acumulação de aniões. Devido à tolerância a condições acídicas, e à reduzida necessidade de manutenção e controlo do pH extracelular, a levedura Saccharomyces cerevisiae é considerada um dos microrganismos mais atrativos para a produção de ácidos orgânicos. Em leveduras, o transporte destes ácidos é realizado por diversas proteínas de membrana, nomeadamente as pertencentes às famílias Jen1 e Ady2. Efectuámos uma caracterização funcional dos homólogos da proteína Jen1 através da expressão heteróloga na estirpe S. cerevisiae jen1 ady2. Foram identificados transportadores de acetato (Dh27), de malato (Dh17) e de succinato (DH18 e Dh24) da levedura Debaryomyces hansenii. Estes estudos indicam ainda que o sacarato é substrato dos transportadores ScJen1-S271Q e KlJen2, o gluconato dos transportadores CaJen2 e KlJen2, e o xilarato e o mucato do transportador CaJen2. Alguns análogos de ácidos orgânicos podem apresentar mais valias a nível terapêutico como é o caso do 3-Bromopiruvato (3BP), um composto com propriedades anticancerígenas e antimicrobianas. Desta forma, avaliou-se também o papel de homólogos de Jen1 pertencente ao microrganismo patogénico Cryptococcus neoformans, no transporte de 3BP. Verificou-se que a proteína Cn04 tem um papel relevante no transporte e sensibilidade das células de C. neoformans ao 3BP. Neste trabalho foram caracterizados vários membros da família AceTr. Verificou-se que a proteína YaaH de Escherichia coli é um transportador ativo secundário de acetato e de sucinato por simporte com protões, e por esse motivo foi proposta a sua designação como SatP (succinate-acetate transporter); o gene aceP da arquea Methanosarcina acetivorans foi identificado como sendo específico para o transporte de acetato por cotransporte com protões; elucidámos ainda o papel da proteína Gpr1 de Yarrowia lipolytica, como sendo um transportador de acetato. A análise filogenética da família AceTr revelou a presença de homólogos na maioria das espécies de fungos analisadas. Dados sobre o seu papel fisiológico sugerem a importância destes transportadores ao longo da evolução, associada à reprodução sexuada por esporulação. Os resíduos de aminoácidos do motivo conservado NPAPLGL(M/S) da família AceTr, foram identificados como essenciais para atividade destes transportadores, uma vez que a substituição de qualquer um destes resíduos de aminoácidos eliminou o transporte de acetato. Globalmente, o presente estudo destacou o amplo número de aplicações para os transportadores de ácidos carboxílicos na biotecnologia industrial. Realça-se o aumento do conhecimento sobre transportadores de ácidos orgânicos e a contribuição sobre a evolução, filogenia e a estrutura dos membros da família AceTr.