In vitro evaluation of an antibiofilm product: a combination between bacteriophages and Portuguese honey

Abstract

Chronic skin wounds represent a major burn both economically and socially. Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli are among the most common colonizers of infected wounds and are prolific biofilm formers. Biofilms are a major problem in infections due to their increasingly difficult control and eradication, and tolerance to multiple prescribed drugs. As so, alternative methods are necessary. Bacteriophages (phages) and honey are both seen as a promising approach for biofilm related infections. Phages have specificity towards a bacterial genus, species or even strain, self-replicating nature, and avoid dysbiosis. Honey has gained acknowledgment due to its antibacterial, antioxidant and anti-inflammatory and wound healing properties. This work presents insights into the antibacterial effects of phage, honey and their combination on P. aeruginosa and E. coli mono and dual species biofilms. This evaluation was achieved through standard antimicrobial activity assays and flow cytometry studies. The selected P. aeruginosa phage (PAO1-D), a Podoviridae, presented plaques surrounded by halo which is an indicative of depolymerase activity, was able to lyse 41.6% of the used strains, had a burst size of 40 released phages per infected cell, and possessed antibacterial activity even after 24 h of treatment. The E. coli specific phage (EC3a), with a burst size of 530 phages per infected cell, possessed also depolymerase activity and belongs to the Siphoviridae family. Two Portuguese honeys (U3 and C1) with different botanical source revealed the same minimum inhibitory concentration value (25% (w/v)) however different in vitro antibacterial activities. In single approaches, phages revealed better efficiency for treatments of short duration, oppositely to honeys that were more effective at longer periods. The combination with 4-fold diluted honey (phage–U325%) in P. aeruginosa biofilms resulted in synergism after 24 h of application (2.84 log viable cell reduction), a result supported by viable cell counts and flow cytometry analysis that revealed an increase of cellular debris when compared to honey treatment alone. Additive effect was perceived at 12 h for E. coli biofilms (3.27 log viable cell reduction) using the combinatorial approach. Compromised cells were not able to regrow, as confirmed by antibiofilm assays. Finally, the presence of a second microorganism in a consortium of species did not affect the effectiveness of the treatment. The work developed reveals a promising approach for the treatment of P. aeruginosa and E. coli biofilm related wound infections.

As feridas crónicas representam um grande encargo tanto a nível económico como social. A Pseudomonas aeruginosa e a Escherichia coli fazem parte dos organismos colonizadores mais comuns nas feridas crónicas, sendo formadoras prolíficas de biofilmes. Estes tornaram-se um dos grandes problemas em infeções devido à crescente dificuldade no seu controlo e erradicação, e tolerância a vários fármacos prescritos. Assim, são necessários métodos alternativos. Os bacteriófagos (fagos) e o mel são vistos como estratégias promissoras para o controlo de biofilmes associados a infeções. Os fagos apresentam especificidade relativa a um género, espécie ou mesmo estirpe, auto replicam-se e não promovem a disbiose. O mel tem ganho reconhecimento devido às suas propriedades antibacterianas, antioxidantes, anti-inflamatórias, assim como em tratamento de feridas. Este trabalho aborda os efeitos antibacterianos dos fagos, mel e a sua combinação em biofilmes simples e mistos de P. aeruginosa e E. coli. Esta avaliação foi conseguida através de ensaios de atividade antimicrobiana padrão e análise de citometria de fluxo. O fago selecionado para P. aeruginosa (PAO1-D), um fago Podoviridae, apresentou placas rodeadas por um halo, um indicativo de atividade de depolimerase, lisou 41.6% das estirpes usadas, libertou 40 fagos por cada célula infetada e manteve atividade antibacteriana mesmo 24 h após tratamento. O fago de E. coli (EC3a), com 530 fagos libertados por célula infetada, também apresentou atividade de depolimerase e pertence à família Siphoviridae. Dois méis portugueses (U3 e C1) com diferente origem floral revelaram a mesma concentração mínima inibitória (25% (w/v)), no entanto diferente atividade antibacteriana in vitro. Nas abordagens individuais, os fagos revelaram uma eficácia maior em tratamentos de menor duração, contrastando com os méis que foram mais eficazes em períodos mais longos. A combinação com mel 4 vezes diluído (fago–U325%) resultou num sinergismo 24 h após aplicação em biofilmes de P. aeruginosa, um resultado suportado pela contagem de células viáveis e análise de citometria de fluxo, que revelou um aumento de restos celulares quando comparado com a aplicação de mel individualmente. Esta mesma abordagem resultou num efeito aditivo às 12 h em biofilmes de E. coli. As células danificadas não tiveram capacidade de crescimento, confirmação obtida pelos ensaios antibiofilme. Finalmente, a presença de uma segunda espécie num consórcio não afetou a eficácia do tratamento. O trabalho desenvolvido revela uma estratégia promissora para o tratamento de biofilmes de P. aeruginosa e E. coli associados a infeções em feridas.