Dysbiotic biofilms increase the inflammatory response in periodontitis

Abstract

Periodontal diseases are perhaps the most common chronic inflammatory diseases in humans. Their main cause is the inflammatory destruction of the tooth-supporting (periodontal) tissues, as a result of bacterial colonization of the tooth, in the form of polymicrobial biofilm communities. An imbalance in the periodontal microbiota and dysbiosis deregulate the host immune response, leading to chronic inflammation. Since little is known about the initiation of dysbiosis, it can be hypothesized that some commensal bacteria can suppress the outgrowth of pathobionts by H2O2 production. However, serum and blood components released during inflammation can neutralize this suppressive effect, leading to the initiation of dysbiosis. The aim of this study is to determine if the neutralizing effect of serum, hemoglobin, hemin and peroxidase on the inhibitory effect of the commensal bacteria on pathobiont growth is translated in a more pronounced immune response. Bacterial quantitative PCR, cellular inflammatory genes and cytokine quantification, by ELISA, were performed to evaluate the pathobiont outgrowth and to detect possible differences in the inflammatory response after exposure of cell cultures to homeostatic or dysbiotic biofilms. Peroxidases, serum and blood components neutralized the inhibitory effect of H2O2 by exogenous peroxidase activity, increasing the pathobiont outgrowth. Exposure of epithelial and fibroblast cultures to these dysbiotic biofilms increased the expression of IL6, IL1β, TNFα, MMP1, MMP2, MMP8, HBD but especially of IL8. Moreover, higher amounts of IL8 were produced after the challenge with dysbiotic biofilms. Conversely, homeostatic and commensal biofilms had a minor inflammatory response at expression and protein level. Overall, serum, peroxidases or blood compounds allowed the outgrowth of pathobionts. Dysbiotic biofilms enriched in pathobionts significantly increased the inflammatory response compared to homeostatic and commensal biofilms.

As doenças periodontais são, talvez, as doenças crónicas inflamatórias mais comuns nos humanos. As principais causas destas complicações são a destruição do tecido que suporta os dentes devido à colonização dos dentes por bactérias que se organizam em biofilmes complexos. A resposta imunitária pode ser desregulada por alterações na composição dos biofilmes, a disbiose, o que leva à inflamação crónica. Apesar de pouco se saber sobre como se inicia a disbiose, pensa-se que algumas bactérias comensais conseguem inibir o crescimento de bactérias patogénicas através da produção de H2O2. No entanto, a presença de soro e de componentes do sangue, libertados durante o processo de inflamação, conseguem neutralizar este efeito inibitório, levando ao início da disbiose. O principal objetivo deste estudo é determinar o efeito que o soro, hemoglobina, hemina e peroxidase têm no efeito inibitório que as bactérias comensais têm sobre o crescimento dos patogénicos e se este efeito se transcreve numa maior expressão da resposta imunitária. Para isso, determinou-se a quantidade de bactérias patogénicas e a expressão de genes inflamatórios usando a técnica de PCR e ainda se mediu a quantidade de uma proteína inflamatória usando a técnica ELISA. Desta forma foi possível avaliar o crescimento de bactérias patogénicas e detetar possíveis diferenças na resposta inflamatória depois de expor as células a biofilmes homeostáticos e disbióticos. Concluiu-se que o soro, hemina, hemoglobina e peroxidase neutralizaram o efeito do H2O2 produzido pelas bactérias comensais, o que resultou num crescimento dos agentes patogénicos. Quando se expuseram as linhas celulares (células epiteliais e fibroblastos) a estes biofilmes disbióticos, a expressão genéticas dos genes inflamatórios IL-8, IL-6, IL-1β, TNF-α, MMP-1, MMP-2, MMP-8 e HBD aumentou, sendo que IL-8 foi o mais expresso. A maior expressão do gene inflamatório IL-8 traduziu-se numa maior produção desta citoquina pelas células, depois destas serem expostas a biofilmes disbióticos. Como esperado, os biofilmes em que não foram induzidas alterações por parte destes componentes do sangue provocaram uma menor resposta inflamatória e menor libertação de proteína IL-8.