Validation and optimization of β-galactosidasev production by Aspergillus lacticoffeatus

Abstract

β-galactosidases (EC 3.2.1.23), also known as lactases, are a family of enzymes that are able to catalyze two different reactions, namely the hydrolysis of lactose and transgalactosylation. The hydrolytic activity is commonly applied in the food industries for reducing the lactose content on dairy products, but it is also important to prevent lactose crystallization problems and to increase the sweetening capacity. Transgalactosylation reactions had been used to synthesize lactose derivatives, such as galactooligosaccharides (GOS), lactulose and lactosucrose. These compounds are classified as prebiotics, which are functional food ingredients, are not digested on the gastrointestinal (GI) tract and are able to stimulate the growth or activity of health-promoting bacteria. The sources of β-galactosidases are extensively distributed in nature, namely in microorganisms, plants and animal organs. Aspergillus lacticoffeatus was chosen for this work as a potential β-galactosidase producer based on preliminary chromogenic tests performed in agar plates. Herein, additional studies carried out under submerged fermentation conditions confirmed the presence of β-galactosidase in the fermentation broth, as well as in the cell extract obtained after cell disruption by ultrasounds. Therefore, this work represents the first time that A. lacticoffeatus is described as a β-galactosidase producer. The enzyme production was evaluated in different fermentation media: synthetic medium composed by lactose (20 g/L), yeast extract (4 g/L), peptone (4 g/L) and salts; and alternative fermentation media with some industrial by-products such as cheese whey and corn steep liquor (CSL). The highest values of extracellular enzymatic activity (444 U/L) were obtained using the synthetic medium. The extracellular enzyme presented a molecular weight between 70–150 kDa and optimal pH and temperature in the range 3.5–4.5 and 50–55 ºC, respectively. The effect of some metal ions (Na+, K+, Li+, Ba2+, Fe2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+, Co2+ and Cu2+), detergents (Triton, SDS and Tween), additives (EDTA, PMSF and ascorbic acid) and sugars (glucose, fructose and galactose) on the enzymatic activity was also evaluated. Finally, the potential application of the enzyme for the synthesis of lactose-based prebiotics was studied and it was demonstrated that the β-galactosidase from A. lacticoffeatus is able to catalyze the transfer reactions involved in the formation of lactulose and GOS.

As β-galactosidases (EC 3.2.1.23), também conhecidas como lactases, são uma família de enzimas capazes de catalisar dois tipos diferentes de reações, nomeadamente a hidrólise da lactose e a transgalactosilação. A atividade hidrolítica é frequentemente aplicada na indústria alimentar na redução do conteúdo de lactose em produtos lácteos, mas é também importante na prevenção da cristalização da lactose e no aumento da capacidade adoçante. As reações de transgalactosilação têm sido usadas na síntese de derivados de lactose, tais como galacto-oligossacáridos (GOS), lactulose e lactosucrose. Estes compostos são classificados como prebióticos, ou seja, ingredientes de alimentos funcionais que não são digeridos no trato gastrointestinal e são capazes de estimular o crescimento ou atividade de bactérias benéficas para a saúde. As fontes de β-galactosidases estão amplamente distribuídas pela natureza, nomeadamente em microrganismos, plantas e órgãos animais. Aspergillus lacticoffeatus foi escolhido para este trabalho como potencial produtor de enzima tendo em conta os resultados preliminares de testes cromogénicos realizados em placas de agar. Neste trabalho, estudos adicionais conduzidos sob fermentações submersas confirmaram a presença de β-galactosidase no caldo da fermentação, assim como no extrato celular obtido após rutura celular por ultrassons. Desta forma, A. lacticoffeatus é aqui pela primeira vez descrito como um produtor de β-galactosidase. A produção da enzima foi avaliada em diferentes meios de fermentação: meio sintético composto por lactose (20 g/L), extrato de levedura (4 g/L), peptona (4 g/L) e sais; e meios alternativos constituídos por resíduos industriais como o soro de queijo e corn steep liquor (CSL). Contudo, os valores mais elevados de atividade enzimática extracelular (444 U/L) foram obtidos usando o meio sintético. A enzima produzida extracelularmente apresentou um peso molecular entre 70 e 150 kDa e o pH e temperaturas ótimos num intervalo entre 3.5–4.5 e 50–55 ºC, respetivamente. O efeito de iões metálicos (Na+, K+, Li+, Ba2+, Fe2+, Mg2+, Zn2+, Mn2+, Co2+ e Cu2+), detergentes (Triton, SDS e Tween), aditivos (EDTA, PMSF e ácido ascórbico) e açúcares (glucose, frutose e galactose) na atividade enzimática foi também avaliado neste trabalho. Finalmente, a potencial aplicação da enzima na produção de prebióticos derivados de lactose foi estudada, tendo-se demonstrado que esta β-galactosidase de A. lacticoffeatus é capaz de catalisar as reações de transferência envolvidas na formação de lactulose e GOS.