Development and validation of a GC-MS based method to analyse faecal bile acids

Abstract

Background: About 5% of the bile acids (BAs) escape enterohepatic recirculation in the terminal ileum and enter the large intestine where they are further metabolized by the colonic microbiota and finally excreted in faeces. The amount and composition of faecal bile acids has been associated to several disease states. Aim: to develop a Gas Chromatography – Mass Spectrometry (GCMS) based method that allows the quantification of bile acids (BA) in faecal samples and to validate this method. Methods: BAs were esterified and silylated to increase their volatility. Standard solutions of cholic acid (CA), deoxycholic acid (DCA), chenodeoxycholic acid (CDCA), litocholic acid (LCA) and usodeoxycholic acid (UDCA) were prepared and used to optimize chromatographic parameters using hyodeoxycholic acid (HDCA) as internal standard. After optimizing the esterification (type of catalyst, temperature and time) and silylation (type and amount of reagent, temperature and time) the optimised method was validated. Intraday and interday precision and accuracy of calibration points was assessed as well as the limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ). Similarly, precision and accuracy were determined for freeze dried stool samples and dried faecal water. Results: Baseline separation of the 5 BAs and internal standard was achieved on an apolar Rxi-1MS column with split injection (split flow 0.25 ml/min) using a He-flow of 1.5 ml/min. Esterification was optimal using HCl 12N as catalyst and heating for 2 h at 60°C whereas the best conditions for silylation were 100 μl of HMDS+TMCS+Pyridine (3:1:9) and heating for 30 min at 55°C. The intraday and interday precision and accuracy was evaluated for each BA and concentration. LOD was 0.05 μg and LOQ was 0.1 μg for most BAs. However, for faecal samples, precision and accuracy were low, despite an additional sonication step and reflux in ethanol to improve the solubilisation of the BAs. Conclusions: Although the performance of the developed method was satisfying for BA standard solutions, its application to faecal samples needs further optimization of the clean-up of the samples prior to derivatisation.

Background: Cerca de 5% dos ácidos biliares escapa à recirculação enterohepática no íleo terminal e entra no intestino grosso onde eles são posteriormente metabolizados pelo microbioma colónico e finalmente excretado nas fezes. A quantidade e composição dos ácidos biliares fecais tem sido associada a vários estados de doenças. Objetivo: desenvolver um método baseado em cromatografia gasosa — espectrometria de massa que permita a quantificação de ácidos biliares em amostras fecais e validar este mesmo método. Métodos: Os ácidos biliares foram esterificados e sililados para aumentar a sua volatilidade. Soluções padrão de ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido quenodesoxicólico, ácido litocólico, ácido ursodesoxicólico foram preparadas e usadas para otimizar parâmetros cromatográficos, usando o ácido hiodesoxicólico como padrão interno. Após a otimização da esterificação (tipo de catalisador, temperatura e tempo) e sililação (tipo e quantidade de reagente, temperatura e tempo), o método otimizado foi validado. A precisão intra-dia e inter-dia e a exatidão dos pontos de calibração foram avaliadas bem como o limite de deteção e o limite de quantificação. Semelhantemente, a precisão e exatidão foram determinadas para amostras de fezes liofilizadas e para água fecal liofilizada. Resultados: A separação da linha de base dos 5 ácidos biliares e do padrão interno foi atingida com a coluna apolar Rxi-1MS com injeção em modo split (fluxo do split 0.25 ml/min) usado com fluxo de He a 1.5 ml/min. A esterificação foi ótima usando HCl 12N como catalisador a uma temperatura de 60°C, durante 2 h, enquanto que as melhores condições para a sililação foram 100 μl de HMDS+TMCS+Pyridine (3:1:9) a uma temperatura de 55°C, durante 30 min. A precisão, intra- e inter-dia, e a exatidão foram avaliadas para cada ácido biliar e cada concentração. O limite de deteção foi 0.05 μg e o limite de quantificação foi 0.1 μg para a maioria dos ácidos biliares. Contudo, para as amostras fecais, a precisão e exatidão foram baixas, apesar do passo adicional da sonicação e refluxo em etanol para melhorar a solubilização dos ácidos biliares. Conclusões: Apesar do desempenho do método desenvolvido ter sido satisfeito para as soluções padrão dos ácidos biliares, a aplicação para as amostras fecais necessita posteriormente de uma otimização na limpeza das amostras antes da derivatização.