The role of monocarboxylate transporters in 3-bromopyruvate effect in cancer cells

Abstract

Cancer is one of the world leading causes of death, being characterized by a set of hallmarks which confer an uncontrolled cellular growth. One of these alterations represents a metabolic reprogramming in which cells rely on glycolysis for energy production over oxidative phosphorylation, even in the presence of oxygen. In several cancers, this activity leads to the production of important amounts of lactate and upregulation of monocarboxylate transporters (MCTs), responsible for lactate export into the extracellular milieu. This energetic adaptation enables cells to sustain the high proliferative rates and promotes an acidic microenvironment. In the beginning of the XXI century, Young H. Ko team has discovered that 3-Bromopyruvate (3BP), an alkylating agent analogue of lactate, was able to target hexokinase-2, a key enzyme of glycolysis in tumors, leading to the depletion of cellular ATP levels and to cancer cell death. Furthermore, in vivo experiments, demonstrated that 3BP was able to eradicate cancer without secondary effects, revealing high selectivity towards cancer cells. In the present work we aimed at deepening our knowledge on the molecular and cellular mechanisms underlying the anticancer selectivity of 3BP to target cancer cells. Due to the structural similarities between 3BP and lactate, we explored the role of MCTs in cancers cells to selectively transport 3BP across the cellular plasma membrane. To address this question, we have studied the correlation between the MCTs expression and the sensitivity to 3BP in three breast cancer cell lines. The cell lines, ZR-75-1, MCF-7 and SK-BR-3 presented different cytotoxicity to 3BP: ZR-75-1 was more sensitive than MCF-7 and SK-BR-3 the most resistant cell line. We have found that pre-treatment of cells with butyrate leads to an increase in 3BP cytotoxic effect. This phenotype was accompanied by an increased expression of MCT-4 and a localization of MCT-1 and its chaperone CD147 in the plasma membrane. These results demonstrated, for the first time, a direct correlation between the expression of MCTs and the cytotoxicity of 3BP. We have then evaluated the kinetics and energetics of 3BP transport across the plasma membrane of cancer cells. We have found that the extracellular acidic environment increases the affinity for 3BP transport, which explains the cytotoxic selectivity of 3BP to cancer cells. Our results demonstrated that MCTs have a dual role in 3BP anticancer mechanism as they participate in the acidification of the tumors extracellular environment by exporting lactate, while promoting the uptake of 3BP. We have demonstrated that the uptake of 3BP via activation of MCT-1, is a process regulated by the presence of the glycosylated form of CD147. The uptake of 3BP upon silencing of MCT-1 and MCT-4 by RNA interference was also addressed. We have observed that inhibition of MCT-1 and MCT-4 expression did not influence 3BP transport possibly due to the upregulation of other transporters not yet identified. 3BP induces drastic alterations in the cytoskeleton of cancer cells. We verified that this phenomenon is accompanied by a reduction in the expression levels of α-tubulin and β-actin. These structural alterations lead to a decrease in cells proliferation and migration capacity, independently of metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 activity, and of E-cadherin expression. An important intracellular target of 3BP is the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). This important glycolytic enzyme also participates in many key processes, such as cytoskeleton assembling. We have found that prior to cytoskeleton alterations, GAPDH appears in the nucleus. This alteration in the intracellular localization occurs in combination with structural changes, as the GAPDH native form was found compromised. This is the first report describing that GAPDH structural alterations impose cytoskeleton disorganization upon 3BP treatment. We attempted a first approach to develop a drug delivery system for 3BP using a structural versatile biopolymer presenting antimicrobial and antitumor activity. The biopolymer did not provide the ideal conditions to sustain a prolonged release of 3BP. However, the system revealed a combined cytotoxic effect of 3BP with the antitumor properties of the biopolymer. Overall, this system presented very promising results to be further exploited towards 3BP application in a clinical context.

O cancro é uma das principais causas de morte no mundo sendo uma doença caraterizada por um conjunto de caraterísticas distintas das células normais resultando num crescimento celular descontrolado. Uma destas alterações implica uma reprogramação metabólica onde as células utilizam preferencialmente a via glicolítica em detrimento da fosforilação oxidativa, mesmo na presença de oxigénio. Esta atividade glicolítica resulta na produção excessiva de lactato e na sobre expressão dos transportadores de monocarboxilatos (MCTs), responsáveis pelo exporte de lactato para o meio extracelular. Esta adaptação energética permite que as células mantenham elevadas taxas de proliferação e promove a criação de um ambiente extracelular acídico. No início do século XXI, a equipa de Young H. Ko descobriu que o agente alquilante 3-bromopiruvato (3BP), análogo do lactato, é capaz de inibir a hexocinase-2, uma enzima crucial na glicólise dos tumores, levando à depleção dos níveis celulares de ATP, resultando na morte celular. Estudos in vivo demonstraram que o tratamento com 3BP conduz ao desaparecimento do cancro sem causar efeitos secundários, mostrando assim uma grande seletividade para as células cancerígenas. Este trabalho visa aprofundar o conhecimento sobre os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à seletividade anticancerígena do 3BP. Devido às semelhanças estruturais entre o 3BP e o lactato, explorámos o papel dos MCTs no transporte do 3BP através da membrana plasmática. Para responder a esta questão, explorámos a correlação entre a expressão dos MCTs e a sensibilidade ao tratamento com 3BP usando, como modelo biológico três linhas celulares de cancro da mama, ZR-75-1, MCF-7 e SK-BR-3. As linhas celulares usadas neste trabalho apresentaram diferentes níveis de sensibilidade ao 3BP, sendo as ZR-75-1 mais sensíveis que as MCF-7 e as SK-BR-3 as mais resistentes. O pré-tratamento com butirato resultou no aumento da sensibilidade ao 3BP. Este fenótipo é acompanhado pelo aumento da expressão do MCT-4, acompanhado pela localização do MCT-1 e da sua chaperona CD147 na membrana plasmática. Estes resultados demonstraram, pela primeira vez, existir uma correlação direta entre a expressão dos MCTs e a citotoxicidade do 3BP. Neste trabalho estudou-se a cinética e a energética do transporte de 3BP através da membrana plasmática das células cancerígenas. Os resultados obtidos indicam que o ambiente extracelular acídico dos tumores aumenta a afinidade do transporte de 3BP, explicando assim a citotoxicidade seletiva do 3BP em células cancerígenas. Deste modo, os MCTs têm uma dupla importância no mecanismo anticancerígeno do 3BP: através da exportação de lactato ocorre acidificação do meio extracelular dos tumores e, em consequência, aumenta a afinidade do transporte para o 3BP. Neste trabalho ficou demonstrado que a entrada de 3BP via ativação do MCT-1 é um processo regulado pela presença da forma glicosilada da proteína chaperon CD147. O silenciamento da expressão do MCT-1 e do MCT-4 foi também abordado usando RNA de interferência. Observou-se que o silenciamento não afetou a capacidade de transportar 3BP possivelmente devido à ativação de outros transportadores ainda não identificados. O tratamento das células tumorais com 3BP conduziu a alterações drásticas no seu citoesqueleto. Verificámos que este fenómeno foi acompanhado pela diminuição dos níveis de expressão de α-tubulina e de β-actina. Estas alterações estruturais resultaram na diminuição da proliferação e migração celulares, independentemente da atividade das metaloproteinases MMP-2 e MMP-9, ou da expressão de E-caderina. A enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), um conhecido alvo do 3BP, é importante não só na glicólise mas também na organização do citoesqueleto. Os nossos resultados indicam que na origem das alterações no citoesqueleto observadas está a ocorrência de localização da GAPDH no núcleo e o comprometimento da sua conformação nativa. Esta é a primeira vez que foi reportado que alterações estruturais na GAPDH, após tratamento com 3BP promovem a desorganização do citoesqueleto. Foi desenvolvida uma primeira abordagem conducente à criação de um sistema de libertação controlada de 3BP usando um biopolímero multifuncional, de origem proteica com propriedades antimicrobianas e antitumorais. O biopolímero não demonstrou as condições ideias para suportar a libertação prolongada de 3BP. Contudo, o sistema revelou o efeito citotóxico combinado do 3BP com as propriedades antitumorais do polímero. Assim, o sistema apresentou-se muito promissor para continuar a ser explorado no futuro tendo em vista a aplicação clínica do 3BP.