Construction of an innocuous Salmonella phage

Abstract

Salmonella is one of the leading foodborne pathogens responsible for illnesses and hospitalizations, and responsible for 38% of the 3000 deaths reported annually (US Center for Disease and Control). Salmonella, present in the gastrointestinal tract of poultry, is passed from bird to bird for instance through contaminated feed and water, environmental sources/vectors, etc. Bacteriophages are bacterial viruses and therefore natural predators of bacteria. Bacteriophages (phages) are harmless to humans and animals, and have been extensively used for prevention and control of bacterial pathogens. In vitro experiments show that phages, alone and in cocktail, can decrease significantly Salmonella levels in contaminated foods; however, the future of phages in food safety is further dependent on the regulatory agencies that still display uneasiness when it comes to the use of phages. This is mostly due to a scarcity of strong scientific evidence, emergence of phage resistant bacterial phenotypes, and the high percentage of genes in phages with unknown function, which can be virulence factors or toxin genes. The main objective of this work was to address the problem of genes of unknown function in a phage genome. To achieve this, the genome sequence of a phage was analysed using bioinformatics tools, all unknown genes were identified and later the whole genome of the phage will be introduced in a bacterial artificial chromosome so that it could be genetically engineered. Phage vB_SenS_Φ38, targeting Salmonella enterica serovar Enteritidis, was genetically characterized and was shown to be 42439 bp in size, dsDNA and to contain 60 open reading frames (ORFs). The study further focused in the 28 hypothetical proteins that exist in the phage genome which were effectively cloned and their antimicrobial activity evaluated. These 28 hypothetical proteins have not shown any antibacterial function, either when expressed in liquid or in solid medium.

A Salmonela é um dos principais agentes patogénicos alimentares responsáveis por doenças e hospitalizações, sendo responsável por 38% das 3000 mortes reportadas anualmente, devido a intoxicações alimentares nos EUA (Centro de Controlo de Doenças dos EUA). A Salmonela, presente no trato gastrointestinal das aves domésticas, pode ser passada de ave para ave através de comida, água contaminada, fontes/vetores ambientais. Os Bacteriófagos (fagos) são vírus bacterianos e por isso são considerados os predadores naturais das bactérias. Os fagos são inofensivos para os humanos e animais e têm vindo a ser utilizados extensivamente para a prevenção e controlo de patogéneos bacterianos. Experiências in vitro têm vindo a demonstrar que os fagos quando estão sozinhos ou misturados com outros fagos (cocktail), conseguem diminuir significativamente os níveis de Salmonela em alimentos contaminados. No entanto, o futuro dos fagos na segurança alimentar encontra-se mais dependente das agências reguladoras, que ainda mostram algum desconforto aquando da utilização dos fagos. Isto deve-se principalmente ao facto de haver uma escassez de fortes evidências científicas, a uma emergência de fenótipos bacterianos resistentes a fagos e devido à alta percentagem de genes fágicos com funções desconhecidas, que podem ser fatores de virulência ou genes de toxinas. O principal objetivo deste trabalho foi o de abordar o problema de genes com função desconhecida no genoma de um fago. Para se conseguir isso a sequência do genoma deste fago foi analisada através do uso de ferramentas bioinformáticas, todos os genes desconhecidos foram identificados e mais tarde todo o seu genoma será introduzido num cromossoma artificial bacteriano de maneira a ser geneticamente manipulado. O fago vB_SenS_Φ38, que ataca Salmonella enterica serovar Enteritidis, foi geneticamente caracterizado e apresentou um genoma com um tamanho de 42439 pb, DNA de cadeia dupla, possuindo 60 open reading frames (ORFs). O estudo foi mais focado nas 28 proteínas hipotéticas que existem no genoma do fago, as quais todas foram clonadas e tiveram a sua atividade antimicrobiana avaliada. Estas 28 proteínas hipotéticas não demonstraram funções antimicrobianas, quer quando expressas em meio líquido ou em meio sólido.