Development of polymeric nanoparticles containing neuroprotective compounds of Hypericum perforatum

Abstract

As doenças neurodegenerativas são cada vez mais prevalentes, particularmente nos países desenvolvidos, onde a esperança média de vida é mais elevada. O stress oxidativo é um dos principais mecanismos envolvidos no processo de neurodegenerescência e na morte neuronal. Os antioxidantes naturais constituem um exemplo de defesas exógenas, particularmente os flavonoides, abundantes na natureza, com uma extensa atividade antioxidante. Foi anteriormente reportado que uma fração de Hypericum perforatum, com atividade antidepressiva extensamente descrita, contendo fundamentalmente quercetina e biapigenina, possuía propriedades neuroprotectoras. A busca por agentes terapêuticos eficazes para patologias do Sistema Nervoso Central tem sido muito elevada. Contudo, a barreira física que a barreira hemato-encafálica representa impede a entrada da maioria dos compostos no cérebro. Não é, portanto, suficiente descobrir novos agentes terapêuticos. É também de extrema importância ultrapassar esta barreira, de modo a aportar o fármaco numa concentração terapeuticamente ativa, no seu local de ação, com o mínimo de perdas e interações. A incorporação de compostos em nanopartículas constitui, assim, uma promissora alternativa terapêutica. Desta forma, o principal objetivo desta tese foi desenvolver nanopartículas poliméricas contendo quercetina e biapigenina, por forma a aumentar a concentração de compostos capaz de atingir o cérebro. Após métodos de isolamento e concentração, 200 mg de uma mistura de quercetina e biapigenina (1:1 m/m) foi obtida e caracterizada por HPLC-DAD. Diferentes formulações de nanopartículas de poli(Ɛ-caprolactona) (PCL) contendo quercetina e biapigenina (racio PCL:quercetin-biapigenin ratio de 1:0.1; 1:0.2 and 1:0.5) foram preparadas por nanoprecipitação e extensamente caracterizadas relativamente a tamanho médio, índice de polidispersão, potencial zeta, eficiência de associação, capacidade de carga e rendimento. Também foi realizada a análise morfológica através de microscopia eletrónica de transmissão (TEM) e espectroscopia de infravermelhos (FTIR). Após otimização de diferentes parâmetros da formulação, uma formulação final estável com um rácio polímero:compostos de 1:0.1 foi obtida, apresentando um tamanho médio de 185 ± 4 nm, potencial zeta de -20.1 ± 1.2 mV e eficiência de associação de 99.7 ± 0.1 %. Após uma libertação inicial in vitro de aproximadamente 68%, na primeira hora, verificou-se uma libertação lenta e sustentada de compostos, atingindo os 75%, após 8 horas, mantendo-se este valor no final de 24 horas. As propriedades antioxidantes da mistura de quercetina e biapigenina livres e encapsuladas foram igualmente investigadas, através de três metodologias distintas: poder sequestrador de radicais, através de DPPH e ensaio de radical superóxido e poder de quelação de ferro. Genericamente, os ensaios de atividade antioxidante demonstraram que as propriedades funcionais dos compostos mantiveram-se, após encapsulação. Dos dois compostos que constituem a mistura, a quercetina é responsável pela atividade sequestradora da mistura, determinada pelos ensaios de DPPH e do radical superóxido e pela ação quelante de ferro (II). A biapigenina será maioritariamente responsável apenas pela última propriedade da mistura. No estudo in vitro, em células HepG2, foi possível verificar que as nanopartículas formuladas protegeram as células hepáticas da toxicidade intrínseca que concentrações elevadas de quercetina e biapigenina apresentam. Nas concentrações mais baixas estudadas, os compostos não encapsulados foram mais eficazes na ação protetora. Dependendo do regime de incubação utilizado e tendo em conta a toxicidade induzida por tert-butil hidroperóxido, as nanopartículas contendo quercetina e biapigenina (no regime de pré-incubação) e os compostos não encapsulados (no regime de co-incubação) foram os mais eficazes na proteção das células HepG2. Tendo em conta o estudo da atividade de quercetina e biapigenin, em células cerebrais, três linhagens celulares foram estudadas: Bv-2, hCMEC/D3 e U87. Os resultados obtidos foram diversificados, dependendo da linhagem celular em questão e do regime de incubação e/ou tempo de incubação selecionado. As propriedades antioxidantes dos compostos em estudo podem explicar, em parte, a sua atividade protetora contra a toxicidade induzida por tert-butil hidroperóxido. O estudo de permeabilidade também efetuado, usando um modelo in vitro de barreira hemato-encefálica, revelou que quer compostos livres como encapsulados conseguem atravessar eficazmente a barreira hemato-encefálica. A quercetina e biapigenina, quando encapsuladas, com permeabilidades aparentes entre 80-85 x 10-6 cm/s, demonstraram maior permeabilidade que os compostos não encapsulados. Tanto quanto é do nosso conhecimento, este é o primeiro estudo sobre o desenvolvimento de nanopartículas poliméricas de quercetina e biapigenina e da sua atividade em células cerebrais. É também a primeira determinação da permeabilidade desta mistura de compostos, sob as formas livre e encapsulada, através da barreira hemato-encefálica. São, contudo, necessários mais estudos, antes de se poderem efetuar ensaios em modelos in vivo, por forma a compreender em mais detalhe a atividade e interações destes nanossistemas no cérebro.

Neurodegenerative disorders are more prevalent, particularly in developed countries, where the lifespan is higher. Oxidative stress is one of the main mechanisms involved in the neurodegenerative process and in neuron death. Natural antioxidants constitute an example of exogenous defense and flavonoids an example of a group of compounds, abundant in nature, that have extensive antioxidant activity. It has been previously demonstrated that a selected fraction of Hypericum perforatum, plant with a known antidepressant activity, containing mainly quercetin and biapigenin, possesses neuroprotective properties. The search for efficient therapeutic agents for Central Nervous System disorders has been extensive. Nevertheless, the physical barrier represented by the blood-brain barrier (BBB) keeps the majority of compounds from entering the brain. It is not enough, therefore, to discover new therapeutic agents. It is also of extreme relevance the overcome of the BBB, in order to deliver a therapeutically active concentration of the drug to the site of action, with the least amount of losses and interactions. The encapsulation of compounds in nanoparticles constitutes a promising therapeutic alternative. Therefore, the main goal of this thesis was to develop polymeric nanoparticles of quercetin and biapigenin, for brain delivery. After isolation and concentration methods, up to 200 mg of a pure mixture of quercetin and biapigenin (1:1 w/w) was obtained and characterized by HPLC-DAD. Different formulations of quercetin-biapigenin poly(Ɛ-caprolactone) (PCL)-loaded nanoparticles (PCL:quercetin-biapigenin ratio of 1:0.1; 1:0.2 and 1:0.5) were prepared by the solvent displacement technique and extensively characterized regarding mean size, polydispersity index, zeta potential, association efficiency, loading capacity and nanoparticle yield. Transmission electronic microscopy (TEM) was also performed, for the analysis of the morphological features of the nanoparticles and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Different formulation parameters were optimized, resulting in a final stable formulation of polymer:compounds ratio 1:0.1 tested of mean particle size of 185 ± 4 nm, zeta potential of -20.1 ± 1.2 mV and association efficiency of 99.7 ± 0.1 %. After an initial in vitro burst release of about 68% in the first hour, sustained and slow release continued reaching 75% after 8 hours. This value maintained until the end of the assay, at 24 hours time. The antioxidant properties of free and encapsulated quercetin-biapigenin were also investigated through three distinct methodologies: scavenging activity, through DPPH and superoxide ion activity and iron (II) chelating activity. In general, antioxidant activity assays revealed that the functional properties of the compounds were maintained after encapsulation. Quercetin is responsible for the scavenging activities of the mixture, assessed by DPPH and superoxide radical assays, and iron (II) chelating activity. Biapigenin is mainly responsible for the last property. In in vitro cell studies, in HepG2 cells, there was perceived that PCL-loaded nanoparticles protect HepG2 cells from intrinsic quercetin and biapigenin toxicity at high concentrations. In lower concentrations compounds in its free form were more effective. Depending on the incubation regimen, regarding t-BOOH-induced toxicity, quercetin-biapigenin PCL-loaded nanoparticles (pre-incubation regimen) and compounds in its free form (co-incubation regimen) were more effective in protecting HepG2 cells. Regarding quercetin-biapigenin protective activity in brain cells, three cell lines were investigated: Bv-2 microglial, hCMEC/D3 endothelial and U87 glioblastoma cells. Results obtained were diverse, depending on the cell line and the incubation regimen and/or time selected. Antioxidant properties of the compounds in study can possibly, but not exclusively, explain the protective activity against t-BOOH-induced toxicity. The permeability study using an in vitro BBB model showed that both quercetin-biapigenin in its free form and encapsulated effectively cross BBB. Encapsulated quercetin-biapigenin, with apparent permeabilities of approximately 80-85 x 10-6 cm/s) revealed to be more permeable than the free compounds. As of our knowledge, this is the first report of the development of quercetin-biapigenin PCL-loaded nanoparticles and of the study of its activity in brain cells. It is also the first determining its permeability through BBB, as an effective nanocarrier for brain delivery. More studies are however necessary, before passing into an in vivo model, to fully understand the activity and interactions of this nanosystems in brain delivery.