The role of Pep4p, the vacuolar yeast protease ortholog of human cathepsin D, in mitochondria-dependent apoptosis

Abstract

Lysosomal cathepsins play a crucial role in cell homeostasis by participating in the degradation of heterophagic and autophagic material. Additionally, following their release into the cytosol, these proteases are involved in pro-apoptotic and anti-apoptotic processes, particularly the aspartic cathepsin D (CatD). Indeed, CatD released into the cytosol triggers a mitochondrial apoptotic cascade. However, CatD can have anti-apoptotic effects in some cellular types and specific contexts. Therefore, targeting this apoptosis regulator in therapies for apoptosis deficiency-associated diseases, such as cancer, requires detailed elucidation of its mechanisms of action. Understanding the molecular mechanisms connecting lysosomal to mitochondrial membrane permeabilization is thus particularly relevant. More recently, vacuolar membrane permeabilization and consequent release of vacuolar proteins into the cytosol was also observed in yeast. It was demonstrated, that Pep4p (yeast CatD), a pepsin-like aspartic protease found in the yeast vacuole and ortholog to human CatD, is released from the vacuole during hydrogen peroxide- or actin stabilization-induced apoptosis. It also translocates into the cytosol during acetic acidinduced apoptosis, and is required for autophagy-independent degradation of mitochondria and for increased cell survival in response to this acid. Furthermore, acetate in colorectal carcinoma (CRC) cells seems to behave as acetic acid in yeast, triggering lysosomal membrane permeabilization (LMP), CatD release and mitochondria-dependent apoptosis. Recently, we found that CatD is involved in autophagy-independent degradation of damaged mitochondria, which renders CRC cells more resistant to apoptosis induced by acetate. These observations, combined with the hints provided by the yeast cell model, support the idea that LMP associated with the release of CatD protects CRC cells from mitochondrial dysfunction during acetate-induced apoptosis through its involvement in degradation of damaged mitochondria. Thus, it has become apparent that the approaches with yeast have already provided and can further offer new perspectives for an enhanced understanding of the role of CatD in mammalian apoptosis, as well of the molecular basis of the crosstalk between the lysosome and mitochondria. Thereafter, we set out to exploit acetic acid-induced apoptosis in Saccharomyces cerevisiae to study the yeast vacuolar protease Pep4p, both concerning its role in mitochondrial degradation and its involvement in the course of apoptosis. In this thesis, it is shown that the protective role of Pep4p in acetic acid-induced apoptosis is independent of the yeast voltage dependent channel Por1p (which has no role on mitochondrial degradation) but dependent on AAC proteins, the yeast adenine nucleotide translocator. Moreover, it has shown that both the Pep4p anti-apoptotic function and its role in mitochondrial degradation depend on Pep4p proteolytic activity. In this study, we also demonstrated that the pro-survival role of Pep4p in acetic acid-induced apoptosis is dependent on mitochondrial respiratory function, and that deficiency in mitochondrial respiration suppresses its role in mitochondrial degradation. Altogether, these results contributed to unveil a novel pro-survival function of CatD in autophagy-independent mitochondrial degradation, which can lead to enhanced cell survival in CRC cells undergoing acetate-induced apoptosis. Moreover, these studies reinforce the use of yeast as a valuable model to elucidate the role of CatD in mammalian apoptosis, as well as the molecular mechanisms involved in the crosstalk between the lysosome and mitochondria.

As catepsinas lisossomais têm um papel crucial na homeostasia celular, participando na degradação de material hetero- e autofágico. Adicionalmente, estas proteases estão envolvidas em processos pró- e anti-apoptóticos após a sua libertação para o citosol, particularmente a catepsina aspártica D (CatD). Com efeito, uma vez no citosol, a CatD desencadeia a cascata apoptótica mitocondrial. Contudo, esta protease pode ter um papel anti-apóptótico. A utilização deste regulador apoptótico como alvo molecular na terapia de doenças associadas a deficiências no processo apoptótico requer portanto uma elucidação detalhada dos seus mecanismos de acção. Por este motivo, a compreensão dos mecanismos moleculares que conectam a permeabilização da membrana lisossomal (PML) à permeabilização da membrana mitocondrial é particularmente relevante. Mais recentemente, observou-se que a permeabilização da membrana vacuolar e consequente libertação de proteases vacuolares para o citosol também ocorre na levedura. Foi demonstrado que a Pep4p, a protease aspártica encontrada no vacúolo da levedura e ortóloga da CatD humana, é libertada do vacúolo para o citosol durante a apoptose induzida pelo peróxido de hidrogénio ou estabilização da actina. Esta protease também é translocada para o citosol durante a apoptose induzida pelo ácido acético desempenhando um papel crucial na degradação mitocondrial independente da autofagia e na sobrevivência celular em resposta a este ácido. Adicionalmente, o acetato em linhas celulares derivadas do carcinoma colorectal (CRC) comporta-se de modo análogo ao ácido acético na levedura, induzindo PML, libertação da CatD e apoptose dependente da mitocôndria. Nós demonstrámos recentemente que a CatD está envolvida na degradação mitocondrial independente da autofagia, o que torna as células do CRC mais resistentes à apoptose induzida pelo acetato. Estas observações, mais as indicações obtidas através do modelo de levedura, reforçam a ideia de que a PML associada à libertação da CatD protege as células do CRC de uma disfunção mitocondrial durante a apoptose induzida pelo acetato, através do seu envolvimento na degradação de mitocôndrias danificadas. Tornou-se então aparente que as abordagens na levedura forneceram informação importante e podem vir a oferecer perspectivas adicionais, contribuindo assim para uma melhor compreensão do papel da CatD na apoptose em mamíferos, bem como das bases moleculares do “crosstalk” entre o lisossoma e a mitocôndria. Por conseguinte, decidimos explorar o modelo da apoptose induzida pelo ácido acético na Saccharomyces cerevisiae para estudar a protease vacuolar da levedura Pep4p, relativamente ao seu papel na degradação mitocondrial e consequentemente seu envolvimento na apoptose. Nesta tese, mostra-se que o papel protector da Pep4p na apoptose induzida pelo ácido acetico é independente do canal de aniões dependente da voltagem de levedura Por1p (que por sua vez não desempenha um papel na degradação mitocondrial), mas é dependente das proteínas AAC, o antiportador mitocondrial de ATP/ADP da levedura. Também foi demonstrado que a função anti-apoptótica da Pep4p, bem como o seu papel na degradação mitocondrial dependem da sua actividade proteolítica. Neste estudo, foi também demonstrado que o papel protector da Pep4p na apoptose induzida pelo ácido acético é dependente da função respiratória mitocondrial, e também que a deficiência na respiração mitocondrial suprime o papel da Pep4p na degradação mitocondrial. Em conjunto, os resultados aqui descritos contribuíram para revelar uma nova função da CatD na degradação mitocondrial independente da autofagia, que pode conduzir a um aumento da sobrevivência nas células do CRC durante a apoptose induzida pelo acetato. Além disso, estes estudos reforçam o uso da levedura como modelo para elucidar o papel da CatD na apoptose de mamíferos, bem como os mecanismos moleculares envolvidos no “crosstalk” entre o lisossoma e a mitocôndria.