Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1822/36053

TitleModulation of the secretome of mesenchymal stem cells for central nervous system regenerative medicine applications
Other titlesModulação do secretoma de células estaminais mesenquimatosas para aplicação na medicina regenerativa do sistema nervoso central
Author(s)Teixeira, Fábio Gabriel Rodrigues
Advisor(s)Salgado, A. J.
Sousa, Nuno
Issue date30-Jan-2015
Abstract(s)The low regeneration potential of the central nervous system (CNS) represents a challenge for the development of new therapeutic strategies. Different possible solutions (e.g. pharmacological, surgical) have been addressed to tackle these problems. However, so far, the outcomes are still not satisfactory, imposing the need for innovative therapeutical approaches. Therefore, several studies have proposed the use of human adult stem cells as a possible tool for CNS regeneration, and within it, human mesenchymal stem cells (hMSCs) have emerged as a valid therapeutic option. In fact, over the last decade, there has been a substantial effort to assess the impact of hMSCs for CNS repair. From the application standpoint, several studies have shown that most of their therapeutic effects has been attributed to their capacity of secreting a wide panel of neuroregulatory molecules (e.g. secretome) capable of inducing neuroprotective/neurodifferentiative actions in the CNS affected regions. Indeed, although it is hypothesized that the hMSCs-secretome plays a major role in these events, little is known on the mechanisms that regulate all these actions. For that, based in all these concepts, the main goal of the work described in this thesis was to analyse and characterize the secretome of hMSCs collected from different culture conditions (static and bioreactor based), as well as to analyse the success of their application in the survival/differentiation of CNS cells both in vitro and in vivo, and in the context of Parkinson’s disease (PD). Results have revealed that the secretome of hMSCs (collected under static conditions) was able to increase neuronal cell survival and differentiation of human telencephalon-derived neural progenitors (hNPCs) in vitro. In vivo, the secretome per se revealed to be also able to increase the levels of proliferation and cell neuronal survival in the dentate gyrus (DG) of adult rat hippocampus when compared to hMSCs cell transplantation. However, the use of standard static culture conditions presents some limitations such as heterogeneous culture environment, limited growth surface area per culture, among others. The latter may somewhat limit, or negatively modulate, the secretome of hMSCs. In order to overcome these drawbacks we have proposed the use of dynamic culturing conditions provided by computer-controlled bioreactors. Based on proteomic analysis, it was possible to observe that use of dynamic culturing conditions was able to enhance the secretory profile of hMSCs secretome when compared to the static conditions, enhancing and supporting neuronal cell survival and differentiation both in vitro and in vivo. In addition to this concept of cell culture modulation, we have also verified that the oxygen concentration also play a role on the paracrine activity of hMSCs. Indeed, when we compared normoxic (21% O2) with hypoxic (5% O2) conditions, proteomic-based results revelead that the use of a hypoxic preconditioning led to an upregulation of several neuroregulatory molecules on the hMSCs secretome. Finally, the possible therapeutic effect of hMSCs secretome, collected from dynamic and static culture conditions, on the recovery of a rat model (6-OHDA) of PD, was also assessed. Results revealed that the injection of hMSCs CM (either from static and dynamic conditions) was able to improve the motor coordination (rotarod test) and the paw reaching motor function of the animals (staircase behavioural test) when compared to 6-OHDA-control group. Additionally, it was also possible to observe that the injection of the hMSCs secretome potentiated the recovery of dopaminergic neurons, thereby supporting the recovery of the parkinsonian rats’ on the motor performance. Thus, both in vitro and in vivo experiments indicate that the modulation of culture conditions could be one of the ways to improve hMSCs secretome potential, which could open new therapeutic opportunities for its application in the future regarding good manufacturing conditions.
A baixa capacidade de regeneração do sistema nervoso central (SNC) representa um dos maiores desafios no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Até ao momento, diferentes abordagens (i.e. farmacológicas ou cirúrgicas) têm sido utilizadas no tratamento de lesões do SNC. Contudo, muito dos resultados obtidos não são de todo satisfatórios, reivindicando assim, a necessidade de criar abordagens terapêuticas alternativas. A transplantação de células estaminais adultas tem sido sugerida como uma potencial ferramenta terapêutica para a regeneração do SNC na qual, o uso de células estaminais mesenquimatosas (MSCs) têm assumido um papel de relevo. De fato, estudos têm sido efetuados no sentido de avaliar o impacto destas células na regeneração do SNC. Sob o ponto de vista de aplicação, tem sido demonstrado que a acção terapêutica das MSCs provém da sua capacidade em secretar um vasto painel de moléculas (designado de secretoma), capaz de promover efeitos de neuroprotecção e neuro-diferenciação em lesões do SNC. Assim, tendo por base estes conceitos, o principal objetivo do trabalho descrito nesta tese foi analisar e caraterizar o secretoma das MSCs recolhido de diferentes condições de cultura (estática ou dinâmica), bem como analisar o sucesso da sua consequente aplicação na sobrevivência e diferenciação de células do SNC in vitro e in vivo, assim como, no âmbito da doença de Parkison (DP). Os resultados obtidos revelaram que o secretoma das MSCs (recolhidos de uma condição estática) foi capaz de aumentar os níveis de sobrevivência e diferenciação neuronal de células estaminais neurais humanas in vitro. Quando aplicado in vivo, o secretoma de MSCs revelou por si só, ser igualmente capaz de aumentar os níveis de proliferação e de sobrevivência neuronal no giros denteado (GD) do hipocampo em comparação ao transplante de MSCs. Contudo, tem sido proposto que o uso de condições estáticas de cultura apresenta consideráveis limitações na performance das MSCs tais como: heterogeneidade do ambiente de cultura, limitação da área de crescimento, problemas de difusão de gases, entre outros. Deste modo, no sentido de ultrapassar tais limitações, o uso de condições dinâmicas de cultura através da utilização de bioreactores controlados computorizadamente foi avaliado. Com base numa análise de proteómica, os resultados revelaram que o uso de uma condição de cultura dinâmica aumentou o perfil de secreção das MSCs em comparação à condição estática. Ao mesmo tempo, verificou-se igualmente que o uso do secretoma das MSCs recolhido da condição dinâmica foi capaz de aumentar e suportar de uma forma significativa os níveis de sobrevivência e diferenciação neuronal in vitro e in vivo em comparação à condição estática. Todavia, tendo por base este conceito de modulação das condições de cultura, verificou-se também, que o uso de diferentes concentrações de oxigénio (21% O2 – normóxia; 5% O2 – hipóxia) era igualmente capaz de modular o perfil do secretoma das MSCs. De fato, após análise de proteómica no secretoma recolhido sob estas condições, foi possível constatar que um précondicionamento sob condições de hipóxia levou a um melhor perfil de secreção das MSCs em comparação ao obtido numa condição de normóxia. Finalmente, no âmbito do trabalho descrito nesta tese, o possível efeito terapêutico do secretoma das MSCs (recolhido de condição estática e dinâmica) na recuperação de um modelo da DP foi igualmente avaliado. Os resultados obtidos, revelaram que a injeção do secretoma das MSCs (quer de condição estática ou dinâmica) foi capaz de melhorar a condição motora dos animais com a DP. Adicionalmente, verificamos que a injeção do secretoma de MSCs, foi igualmente capaz de potenciar a sobrevivência dos neurónios dopaminérgicos ao nível da substância nigra, suportando assim as melhorias observadas na componente motora dos animais. Sendo assim, as experiências efetuadas no trabalho descrito nesta tese (in vitro e in vivo) revelaram que a modulação das condições de cultura das MSCs poderá ser uma estratégia credível para aumentar o potencial terapêutico do seu secretoma, podendo deste modo levar à criação de novas oportunidades terapêuticas para a sua aplicação no âmbito da medicina regenerativa do SNC.
TypeDoctoral thesis
DescriptionTese de Doutoramento em Ciências da Saúde
URIhttp://hdl.handle.net/1822/36053
AccessOpen access
Appears in Collections:BUM - Teses de Doutoramento
ICVS - Teses de Doutoramento

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