Implementation of the fermentation strategies for lactic acid bacteria

Abstract

Lactococcus lactis is a Gram-positive bacterium with a generally regarded as safe (GRAS) status and a long standing history in industrial fermentations. It is often used as a starter culture in dairy products and contributes to the organoleptic characteristics of these same products. L. lactis is the most studied lactic acid bacteria and is nutritionally exigent. The present work aims to implement fermentation processes to optimize lactic acid bacteria growth, focusing in the identification of the best set of culture medium and environmental conditions. The strain used in this study was the L. lactis IL 1403, a organism derived from a dairy starter strain. Biomass optimization was firstly examined by testing two carbon sources. In these experiments, the growth was evaluated using a bioreactor with control of temperature, pH and dissolved oxygen. The maximum biomass concentration (0.752 g.L-1) was obtained in complex medium supplemented with 5 g.L-1 lactose (CML). On the other side, growth in complex medium with 5 g.L-1 of glucose showed a growth rate approximately 32 % lower in comparison with CML. As opposed to what was observed in the complex medium, cells were not able to grow in a minimal defined medium supplemented with lactose. Additionally, the impact of pH control in IL 1403 growth was investigated in bioreactor versus non-pH control. As expected, the highest biomass concentration was obtained with pH control, corresponding to 0.696 g.L-1. A 38 % decrease in the biomass formation was observed for the non-controlled pH cultivation. Afterwards, this work aimed at designing a minimal defined medium for L. lactis growth. For that purpose, the growth of L. lactis in the defined media SA, MS 10 and a modified SD3 was characterized. In the modified SD 3 medium, IL 1403 was able to grow until an optical density of 1, contrary to the other media where growth was not observed. Nevertheless, the modified SD3 medium does not satisfy the initial goal, since it is a complete medium. Therefore, other compositions were evaluated using as a base the modified SD3 medium. Under this scope, four main groups of nutrients were tested: mineral base, vitamins, nitrogen bases and amino acids compositions, which then were explored individually. From these experiments it was possible to conclude that an increase in K2HPO4 concentration from the mineral base favours growth; Vitamins tuning had no positive effect on IL 403 growth; and although not being essential to guarantee growth, nitrogen bases had a stimulatory effect. Furthermore, the set of essential amino acids for this strain were concluded to be methionine, valine, leucine, proline, serine, histidine, glutamine, asparagine, cysteine and threonine. This achievement was of great importance due to the lack of consensus in the literature regarding the essential amino acids requirements for this strain.

Lactococcus lactis é uma bactéria Gram-positiva com estatuto GRAS e com um longo historial em processos fermentativos. Trata-se da bactéria do ácido láctico (BAL) mais estudada e é nutricionalmente exigente. É frequentemente usada como uma cultura de arranque em produtos lácteos e contribui para as características organoléticas dos mesmos. O presente trabalho visava a implementação de estratégias de fermentação com o objetivo de otimizar o crescimento desta BAL, focando-se na identificação do melhor meio de cultura, assim como das melhores condições ambientais. A estirpe usada neste trabalho foi a L. lactis IL 1403 que não possui plasmídeo e deriva de culturas de arranque de produtos lácteos. Primeiramente foram avaliadas duas fontes de carbono na otimização da produção de biomassa. Nestes ensaios, o crescimento bacteriano foi avaliado num bioreator com controlo da temperatura, do pH e do oxigénio dissolvido. A concentração máxima de biomassa, 0,752 g.L-1, foi obtida em meio complexo suplementado com 5 g.L-1 de lactose (MCL). Por sua vez, no meio complexo com 5 g.L-1 de glucose, a taxa de crescimento obtida foi 32 % inferior à registada no MCL. Adicionalmente foi avaliado, em bioreator, o impacto do controlo do pH no crescimento da IL 1403 comparando-o com a ausência de controlo do mesmo. Como esperado, a maior concentração de biomassa, 0,696 g.L-1, foi obtida no ensaio com controlo de pH, tendo-se obtido menos 38 % no ensaio sem controlo. Ao contrário do que se observou em meio complexo, L. lactis IL 1403 não foi capaz de crescer em meio mínimo definido com lactose. O crescimento da L. lactis em diferentes meios definidos (SA, MS10 e meio SD 3 modificado) foi, também, caracterizado. Em meio SD 3 modificado, a estirpe IL 1403 cresceu até uma densidade ótica máxima de 1, enquanto nos restantes meios não foi observado crescimento. No entanto, o meio SD 3 modificado não satisfaz um dos objetivos estabelecidos, por ser um meio definido completo. Desta forma, este meio foi usado como base para definir um meio mínimo para a L. lactis IL1403. Neste âmbito, a composição dos 4 principais grupos de nutrientes (base mineral, vitaminas, bases azotadas e aminoácidos), foi testada individualmente. Destes ensaios pode-se concluir que o aumento da concentração do K2HPO4 influencia fortemente o crescimento; a redução das vitaminas não afeta o crescimento da IL 1403 e as bases azotadas estimulam o crescimento, não sendo por isso consideradas essenciais. Por fim, os aminoácidos essenciais determinados para esta estirpe são a metionina, valina, leucina, prolina, serina, histidina, glutamina, asparagina, cisteína e treonina. Esta última informação foi de maior importância devido à falta de consenso na literatura sobre os requisitos mínimos para a IL1403 em relação aos aminoácidos. Em suma, neste trabalho foi otimizada a produção de biomassa e determinado o meio mínimo para a L. lactis IL 1403.