Desenvolvimento de abordagens de espectroscopia de fibra ótica para a análise em alto débito de estirpes de Saccharomyces cerevisiae

Abstract

O objetivo deste trabalho consistiu na implementação de um teste espectrométrico miniaturizado e de alto rendimento para a análise de estirpes de Saccharomyces cerevisiae da coleção do Centro de Biologia Molecular e Ambiental da Universidade do Minho. Para atingir esse objetivo foi necessário desenvolver um suporte para microplacas de 96 poços onde se realizaram as medições, no sentido de encontrar as melhores condições de crescimento para as estirpes e a posterior aquisição dos espectros. Os espectros foram adquiridos na zona da luz ultravioletavisível- infravermelha próximo de ondas curtas (200 – 1100 nm). As estirpes utilizadas foram inoculadas em meio YPD agarizado numa microplaca de 96 poços. Os espectros obtidos foram submetidos a pré-tratamentos e posteriormente a análise de componentes principais relevantes e a análise discriminante por mínimos quadrados parciais, quando indicado. Ensaios preliminares de otimização sugeriram a necessidade de ter em atenção determinados cuidados para minimizar os erros provenientes do material utilizado e que podiam interferir com a análise espectral das estirpes. Foi demonstrada a possibilidade de distinguir 11 estirpes da levedura S. cerevisiae, provenientes de diferentes localizações geográficas e origens de isolamento, bem como de 9 isolados isogénicos da estirpe comercial de vinificação Zymaflore VL1 (Lallemand), desde que se consideram condições experimentais muito padronizados como, por exemplo, a obtenção de espectros que foram obtidos na mesma microplaca. Com esta abordagem foi alcançada uma boa reprodutibilidade de réplicas de crescimentos e medições espectrométricas. No entanto, não foi obtida uma boa reprodutibilidade entre microplacas contendo as mesmas estirpes. Verificou-se também que a semelhança espectral não está relacionada com a localização geográfica e/ou a origem do isolamento das estirpes. As modificações espectrais foram também registadas durante o crescimento das estirpes nos poços das microplacas. As análises posteriores distinguiram as diferentes fases de crescimento, mas para o tempo de incubação entre 42 h e 76 h não se verificaram diferenças espectrais significativas. Em todas as experiências anteriores, a identidade de cada estirpe analisada era conhecida. Para validar este método espectroscópico foi necessário verificar a possibilidade de se conseguir distinguir isolados da estirpe S. cerevisiae sem conhecimento prévio da sua identidade. Os resultados das análises espectrais obtidos foram comparados com os de perfis moleculares (análise interdelta) destes isolados e não se observou uma correspondência entre o número de estirpes identificado por cada um dos métodos. Por este motivo, trata-se de uma técnica que não poderá ser utilizada para distinguir estirpes cuja identidade seja desconhecida. Sendo uma técnica no início do seu desenvolvimento, verificou-se a ocorrência de vários problemas sistemáticos nas experiências realizadas, inerentes ao material utilizado e devido à variação na composição das microplacas e do meio de cultura. Contudo, foram apresentadas soluções para a obtenção de resultados mais fiáveis e reprodutíveis no futuro.

The aim of this work was to develop a high-throughput spectrometric assay for the analysis of Saccharomyces cerevisiae strains from the collection of the Centre for Molecular Biology and Environment, University of Minho. To achieve this goal it was necessary to develop a support for 96-well microplates for small-scale spectra acquisition and for the development of the best growth conditions. The spectra were acquired in the region of ultraviolet-visible-near infrared short wave light (200 - 1100 nm). The strains used were inoculated in wells of a 96-well microplate containing YPD agar. The spectra obtained were subjected to pre-treatments and subsequently to relevant principal components analysis and the discriminant analysis by partial least squares, whenever indicated. Preliminary optimization tests suggested the need to consider several aspects (such as the material used), that could interfere with the spectral analysis of the S. cerevisiae strains. It was possible to distinguish between 11 S. cerevisiae strains from different geographical locations and sources of isolation and 9 isogenic isolates of the commercial winemaking strain Zymaflore VL1 (Lallemand), that were re-isolated from vineyards when the obtained spectra derived from a single microplate. The distinction of strains occurred with a good reproducibility of the four replicates included in each microplate. However, a lack of reproducibility occurred between spectra obtained from different microplates that contained the same strains. It was also found that the spectral similarity of strains did not correlate with the geographic localisation and the source of isolation. Spectral analyses distinguished different stages of exponential cellular growth, whereas no significant spectral differences were recorded between 42 h and 76 h of growth. In all previous experiments, the identity of each strain analysed was known. For further validation of this spectroscopic method, we evaluated the ability to distinguish among several S. cerevisiae isolates that were previously characterized by interdelta analysis. The comparison of results from spectral analysis with interdelta profiles revealed the number of strains identified by each method was different. We herein developed a first exploratory approach for the high throughput analysis of S. cerevisiae strains by fiber optics spectroscopy. Several systemic problems, inherent to the materials used, such as variation in the composition of the microplate and the culture medium still need to be solved and we present solutions for the achievement of more reliable and reproducible results in the future.