The emerging role of autophagy/mitophagy in α-synuclein-induced toxicity: studies on the yeast chronological aging model

Abstract

α-Synuclein (α-syn) misfolding and aggregation is strongly associated with both idiopathic and familial forms of Parkinson disease (PD). Evidence suggests that α-syn has an impact on cell clearance routes and protein quality control systems, such as the ubiquitin-proteasome system (UPS) and autophagy. Recent advances in the key role of the autosomal recessive PARK2/PARKIN and PINK1 genes in mitophagy, highlighted this process as a prominent new pathogenic mechanism. Nevertheless, the role of autophagy/mitophagy in the pathogenesis of sporadic and autosomal dominant familial forms of PD is still enigmatic. The yeast Saccharomyces cerevisiae is a powerful “empty room” model that has been exploited to clarify different molecular aspects associated with α-syn toxicity, which combines the advantage of being an established system for aging research. Here, we showed that the heterologous expression of α-syn WT or the A53T mutant form induced toxicity, additionally the toxic phenotype was more aggravated when the α-syn expression was induced at the stationary cells growth phase. At this growth phase, it was demonstrated that the induction of the toxic α-syn variants led to the stimulation of the unfolded protein response (UPR), by the activation of the Ire-Hac1 signaling pathway. The activation of this pathway is probably responsible by the induction of the ATG6 and ATG8 mRNA levels, linked with autophagy and ATG32, ATG33 and DNM1 mRNA levels, which are genes specifically associated with mitophagy, suggesting that autophagy and mitophagy are stimulated under α-syn-induced toxicity. In fact modulation of autophagy, by its inhibition with chloroquine or 3 methyladenine, reverted the α-syn toxic phenotype detected by an extension of in the chronological life span (CLS) of cells expressing the α-syn WT or A53T mutant forms. Additionally, with the specific method to quantify the autophagy or mitophagy activities, the alkaline phosphatase assay, it was confirmed that the toxicity due to the heterologous expression of the toxic α-syn variants was accompanied by exacerbated stimulation of both autophagy and mitophagy. Modulation of mitophagy, by its impairment, achieved by deletion of ATG11 or ATG32 resulted in a CLS extension, accompanied by physiologic autophagic levels, further implicating mitophagy in the α-syn toxicity. It is established that reactive oxygen species, particularly superoxide anion (O22-), are associated with autophagy induction. In the experimented conditions, the stimulation of autophagy/mitophagy under α-syn expression was accompanied with O22- accumulation. Nevertheless, cells with impaired mitophagy display lower levels of O22-. Thus, the findings do not rule out O22- as inducer of autophagy in these conditions. Other molecules that have been associated with the regulation of autophagy in higher eukaryotic cells are the sirtuins, particularly the SIRT1. Deletion of SIR2, the yeast homologue of SIRT1, essential for α-syn-induced toxicity, abolished autophagy and mitophagy, thereby rescuing cells from α-syn toxicity. These data show that Sir2 functions as a regulator of autophagy, like its mammalian homologue, SIRT1, but also of mitophagy, mediating the ATG32 mRNA levels. Caloric restriction (CR) is a physiologic intervention known to promote life span extension, by reducing the activity of various signal transduction pathways either directly or through the decrease in the activity of nutrient-sensing pathways. Wild type cells submitted to CR experienced a CLS extension accompanied by physiological levels of autophagy/mitophagy, independently of the expression of α-syn toxic variants. In fact, in α-syn-induced toxicity conditions, autophagy/mitophagy induction was significant lower in comparison with the same cells submitted to non-CR conditions, supporting the hypothesis that induction of autophagy/mitophagy are directly related with the α-syn-induced toxicity. CR, like mitophagy abrogation, has the capacity to reduce α-syn-induced toxicity. The observed high CLS of atg11 and atg32 cells expressing α-syn WT or A53T mutant form in comparison with the wild type cells submitted to the same conditions, suggested that CR controls autophagy/mitophagy independently, or at least partially independent, of the pathways regulating mitophagy . Similar results were observed in sir2 cells, in which CR is able to further increase the CLS of sir2 cells expressing α-syn toxic variants, suggesting that under CR conditions, the activated signaling pathways are independent of Sir2. Altogether our work highlights that α-syn expression is associated with autophagy, particularly mitophagy stimulation mediated by the regulation of ATG32 by Sir2, an important phenomenon linked to α-syn-induced toxicity during aging. These findings open new insights to the study of the mechanism associated with PD pathogenesis in higher eukaryote organisms.

A acumulação intracelular da proteína α-sinucleina (α-sin) com alterações conformacionais leva à formação de agregados que estão associados com as formas idiopática e familiar da doença de Parkinson (DP). Evidências sugerem que a α-sin interfere com as vias de degradação proteica e com o sistema de controlo de qualidade das proteínas, tais como o sistema ubiquitina-proteasoma e a autofagia. Um papel fundamental das proteínas PARK2/PARKIN e PINK1, cujos genes estão envolvidos em formas autossómicas recessivas da DP, na regulação da mitofagia, destacam este processo como um novo proeminente mecanismo patogénico da DP. No entanto, o papel da autofagia/mitofagia na patogénese das formas esporádica e familiar autossómica dominante da DP é ainda enigmático. A levedura Saccharomyces cerevisiae é um poderoso modelo, que tem sido explorado para esclarecer diferentes aspectos moleculares associados com a toxicidade da α-sin, combinando a vantagem de ser um sistema estabelecido para o estudo do envelhecimento. Este trabalho demonstra que a expressão heteróloga da α-sin selvagem ou da forma mutante A53T induz toxicidade, que é mais evidente quando a expressão da α-sin foi induzida em células envelhecidas (pós-mitóticas em fase estacionária de crescimento). A expressão das variantes tóxicas de α-sin levou à ativação de uma resposta específica da célula através da via de sinalização Ire-Hac1. A activação desta via é, provavelmente, responsável pelo aumento dos níveis de mRNA dos genes ATG6 e ATG8, associados com o processo autofágico, e também dos genes ATG32, ATG33 e DNM1, especificamente associados com a mitofagia, sugerindo que a autofagia e a mitofagia estão implicadas na toxicidade induzida pela expressão de α-sin. De fato, a modulação da autofagia, através da sua inibição com cloroquina ou 3 metiladenina reverteu o fenótipo tóxico da α-sin, detetado através do aumento da longevidade cronológica das células. Paralelamente, com o auxílio de um método específico para a quantificação da atividade autofágica ou mitofágica, confirmou-se que a toxicidade devida à expressão heteróloga das variantes tóxicas de α-sin foi acompanhada pela estimulação exacerbada do processo autofágico e mitofágico. A modelação da mitofagia, através da sua inibição, por deleção dos genes ATG11 ou ATG32, resultou numa extensão da longevidade cronológica, acompanhada por níveis autofágicos fisiológicos, implicando a mitofagia na toxicidade induzida pela α-sin. Está estabelecido que as espécies reactivas de oxigénio, em particular o anião superóxido (O22-), regulam a indução de autofagia. Nas condições em estudo, a estimulação da autofagia/mitofagia em células a expressar α-sin foi acompanhada pela acumulação de O22-. No entanto a acumulação de O22- não é observada em células incapazes de realizar mitofagia. Assim, os resultados não descartam a possibilidade de O22- estar a contribuir para a indução da autofagia, em condições de toxicidade induzida pela α-sin. Outras moléculas que têm sido associadas com a regulação da autofagia, em células eucariotas superiores, são as sirtuinas, particularmente SIRT1. A deleção de Sir2 (proteína de levedura homólogo de SIRT1), cujo seu papel foi previamente demonstrado como sendo crucial para a toxicidade da α-sin, resultou na supressão da autofagia e da mitofagia, e consequentemente numa melhor performance das células. Estes dados mostram, pela primeira vez, que Sir2 para além de ser uma molécula reguladora da autofagia, tal como o seu homólogo de mamífero, SIRT1, regula também a mitofagia, controlando os níveis de mRNA do gene ATG32. A restrição calórica (RC) é uma intervenção fisiológica que promove a extensão da longevidade, reduzindo diretamente a atividade de várias vias de transdução de sinal, ou diminuindo a actividade das vias de sinalização de nutrientes. As células da estirpe selvagem submetidas a RC demonstraram uma extensão na longevidade cronológica, acompanhada por níveis fisiológicos de autofagia/mitofagia, independentemente da expressão das variantes tóxicas de α-sin. No entanto, esta indução foi significativamente menor quando comparada com as mesmas células submetidas a condições de não-RC, corroborando a hipótese de que a RC tem a capacidade de reduzir a toxicidade induzida por expressão da α-sin. Adicionalmente, células deletadas no gene ATG11 ou ATG32, a expressar α-sin selvagem ou a forma mutante A53T, quando sujeitas a RC apresentaram uma maior longevidade cronológica em comparação com as células da estirpe selvagem submetidos às mesmas condições, o que sugere que a RC tem a capacidade de controlar a toxicidade, devido a expressão de α-sin, por mecanismos independentes, ou pelo menos parcialmente independentes, dos mecanismos que estão na base da regulação da mitofagia. Os mesmos resultados foram observados para as células deletadas no gene SiR2, sugerindo que a RC regula a autofagia/mitofagia por vias de sinalização independentes de Sir2. Em suma, o nosso trabalho sugere que a expressão de α-sin promove a estimulação da autofagia, particularmente da mitofagia, e que esta indução é regulada pelos níveis de mRNA do gene ATG32, através da acção da proteína Sir2, um evento relevante ligado à indução da toxicidade de α-sin, durante o envelhecimento. Estes resultados abrem novas perspectivas para o estudo de mecanismos associados com a patogénese da DP, em organismos eucariotas superiores.