Involvement of the gene CaRLM1 in Candida albicans virulence

Abstract

The cell wall is an essential structure that maintains the viability of fungal cells, conferring their typical morphology and protection. As the most external cellular structure of pathogenic microorganisms, it also carries important antigenic determinants and mediates adhesion to the host tissues, being crucial to initiate colonization and to cause disease. Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans respond to cell wall perturbations by activation of the cell wall integrity (CWI) mitogen-activated protein (MAP) kinase pathway (also known as the PKC pathway). In S cerevisiae one of the transcription factors of this signalling cascade is the MADS-box protein Rlm1, of which an orthologue was identified in C. albicans based solely in sequence homology. In this thesis we aimed at studying the molecular diversity and functional characterization of the RLM1 gene as well as its involvement in C. albicans cell wall maintenance and virulence. Candida albicans Rlm1 is a transcription factor that presents a great variability at its C-terminus, conferred by the CAI microsatellite. One hundred twenty-three C. albicans isolates were genotyped with CAI microsatellite (CAA/G)n and 35 alleles were found with repeat units varying from 11 to 49. Interestingly the strains with higher number of (CAA/G) repetitions displayed higher tolerance to cell wall stress agents. These observations suggested that CAI repetitive region confers a high genetic variability to the RLM1 gene, which is reflected in different strain susceptibilities to different stress conditions, conferring a higher plasticity to C. albicans isolates. To determine if C. albicans RLM1 is involved in the CWI pathway, as described for S. cerevisiae, a rlm1Δ/rlm1Δ mutant was constructed, using the SAT1-flipping strategy to avoid the use of auxotrophic markers, and its functional characterization was performed. The wild-type (WT), mutant (rlm1Δ/rlm1Δ) and complemented (rlm1Δ/rlm1Δ+RLM1) strains were tested with several cell wall stress agents in parallel with S.cerevisiae rlm1Δ mutant and WT strains. Candida albicans rlm1Δ/rlm1Δ mutant displayed phenotypes associated to cell wall deficiency such as, hypersensitivity to Congo red, caspofungin and calcofluor white. Upon osmotic stabilization with 1M sorbitol, the caspofungin phenotype was reverted, suggesting cell wall weakening in the mutant. Quantification of cell wall components showed a two-fold increase in chitin and mannans in the C. albicans rlm1Δ/rlm1Δ mutant in comparison with the WT strain. The S. cerevisiae rlm1Δ mutant displayed several phenotypic differences in comparison with the rlm1Δ/rlm1Δ mutant of C. albicans: insensitivity to Congo red and caspofungin, more resistance to calcofluor white, and higher sensitivity to SDS. In agreement with a transcription factor function, we found evidence indicating nuclear localization of the Rlm1-GFP fusion protein. Microarray analysis showed that the absence of a functional C. albicans RLM1 significantly increased transcription of genes involved in cell adhesion, like ECE1, ALS1, ALS3, HWP1, RBT1, and decreased transcription of genes involved in the catabolism of carbohydrates, DAK2, GLK4, NHT1 and TPS1. The increased transcription of genes involved in cell adhesion correlated well with adhesion and biofilm assays. These results and the homology with other MADS-box Rlm1 transcription factors strongly suggest that C. albicans RLM1, like the S. cerevisiae orthologue, is involved in cell wall remodeling. Furthermore, the increase of cell adhesion binding proteins involved in biofilm formation was confirmed in the rlm1Δ/rlm1Δ mutant in comparison with the WT strain, suggesting that C. albicans Rlm1 acts as a negative biofilm regulator. The involvement of the Rlm1 transcription factor of the human fungal pathogen C. albicans in virulence was evaluated in a murine model of disseminated candidiasis. Mice infected with rlm1Δ/rlm1Δ mutant cells presented a higher survival time than mice infected with the WT and complemented strains, both presenting higher fungal burden and invasive micelial growth through kidneys in hystopathological analysis. Additionally, in the murine macrophage-like cell line J744A, the TNF-α was lower in response to rlm1Δ/rlm1Δ mutant and the cellular toxicity, measured as extracellular lactate dehydrogenase activity, caused by this mutant was significantly lower in comparison with the WT and complemented strains. Finally, qRT-PCR determination showed that the expression of the cell wall-related genes, CRH11 and PHR2, was clearly higher in rlm1Δ/rlm1Δ mutant in relation to WT strain, in mRNA of kidney samples after 7 days post-infection. Since these proteins are part important of the cell wall and in vivo the yeast cells are under constant cell wall stress by the immune system, it is conceivable that the mutant presents a higher expression of these genes, which may compensate the weakened cell wall. Overall, these results showed that the transcription factor Rlm1 is involved in the stability of the cell wall in the interaction with the host, being important for the virulence of C. albicans and invasion of the kidneys during hematogenously disseminated candidiasis. Altogether, the objective proposted in this thesis were achieved, demonstrating that RLM1 gene is an important transcription factor involved in C. albicans cell wall remodelling, such that the mutant is practically avirulent. Additionally, we also think that this yeast developed a way of increasing the genetic variability of this important gene (through CAI repetitive region), confering a high plasticity to C. albicans isolates.

A parede celular é uma estrutura essencial responsável pela manutenção da viabilidade das células fúngicas, conferindo-lhes morfologia típica e protecção. Como estrutura celular mais externa de microrganismos patogénicos, contém determinantes antigénicos importantes e medeia a adesão aos tecidos do hospedeiro, sendo essencial para iniciar a colonização e, portanto, causar doença. As células de Saccharomyces cerevisiae e Candida albicans respondem a perturbações da parede celular através da activação da via “mitogenic activated protein kinase” (MAPK) da integridade da parede celular (CWI), também conhecida como a via da PKC. Um dos factores de transcrição presente nesta cascata de sinalização é a proteína MADS-box Rlm1, cujo ortólogo em C. albicans foi identificado apenas por homologia de sequência. A presente tese teve como objectivo o estudo da diversidade molecular e caracterização funcional do gene RLM1, bem como estudo da sua participação na manuntenção da parede celular e virulência de C. albicans. A proteína Rlm1 de C. albicans é um factor de transcrição que apresenta uma grande variabilidade na sua extremidade terminal C, conferida pelo microssatélite CAI. Cento e vinte e três isolados de C. albicans foram genotipados com microssatélite CAI (CAA/G)n e 35 alelos foram encontrados com unidades repetitivas variando entre 11 a 49. È interessante notar que as estirpes com maior número de repetições (CAA/G) apresentaram maior tolerância a agentes de stresse da parede celular. Estas observações sugeriram que a região repetitiva CAI confere uma alta variabilidade genética ao gene RLM1, que se reflecte em diferentes susceptibilidades das estirpes a diferentes condições de stresse, conferindo uma elevada plasticidade aos isolados de C. albicans. De forma a determinar se o gene RLM1 de C. albicans está envolvido na via CWI, como descrito para S. cerevisiae, foi construído o mutante rlm1Δ/rlm1Δ utilizando a estratégia SAT1-flipping, de modo a evitar o uso de marcadores de auxotrofia. A estirpe selvagem (WT), a estirpe mutante (rlm1Δ/rlm1Δ) e a complementada (rlm1Δ/rlm1Δ+RLM1) foram testadas com vários agentes de stresse da parede celular em paralelo com as estirpes WT e rlm1Δ de S. cerevisiae. O mutante de C. albicans rlm1Δ/rlm1Δ apresentou fenótipos associados à deficiência de parede celular, tais como, a hipersensibilidade ao Congo red, à caspofungina e ao calcofluor white. O fenótipo com caspofungina foi revertido por estabilização osmótica com sorbitol 1M, indicando enfraquecimento da parede celular no mutante. A quantificação de componentes da parede celular mostrou um aumento de duas vezes em quitina e mananos no mutante rlm1Δ/rlm1Δ de C. albicans em comparação com a estirpe WT. A estipe mutante rlm1Δ de S. cerevisiae exibiu várias diferenças fenotípicas em comparação com o mutante rlm1Δ/rlm1Δ de C. albicans: insensibilidade ao Congo red e caspofungina, uma maior resistência ao calcofluor white e uma maior sensibilidade ao SDS. De acordo com a função de factor de transcrição, encontramos dados indicando a localização nuclear da proteína de fusão Rlm1-GFP. A análise de “microarrays” demonstrou que a ausência do gene RLM1 em C. albicans induziu um aumento significativo na transcrição de genes envolvidos na adesão celular, tais como, ECE1, ALS1, ALS3, HWP1, RBT1 e uma diminuição na transcrição de genes envolvidos no catabolismo de hidratos de carbono, tais como, DAK2 GLK4, NHT1 e TPS1. O aumento na transcrição de genes envolvidos na adesão celular foi confirmados por resultados em ensaios de aderência celular e formação de biofilme. Estes resultados e a homologia com outros factores de transcrição MADS-box do mesmo tipo sugerem fortemente que o gene RLM1 de C. albicans, bem como o seu ortólogo em S. cerevisiae, estão envolvidos na remodelação da parede celular. Além disso, observou-se um aumento de proteínas de adesão celular envolvidas na formação de biofilme no mutante rlm1Δ/rlm1Δ em comparação com a estirpe WT, sugerindo que o RLM1 de C. albicans actua como um regulador negativo da formação de biofilme. Por fim o envolvimento do factor de transcrição Rlm1 de C. albicans na virulência foi avaliado num modelo murino de candidíase disseminada. Ratinhos infectados com células mutantes rlm1Δ/rlm1Δ apresentaram um maior tempo de sobrevivência do que ratinhos infectados com as estirpes WT e complementada, estas últimas apresentando uma maior carga fúngica e crescimento micelial invasivo através dos tecidos na análise histopatológica dos rins. Além disso, na linha celular murine macrophage-like J744A, a produção de TNF-α foi menor em resposta ao mutante rlm1Δ/rlm1Δ e a toxicidade celular, medida pela actividade extracelular do lactato desidrogenase, foi significativamente mais baixa em comparação com as estirpes WT e complementada. Mais, a quantificação por qRTPCR demonstrou que a expressão dos genes relacionados com parede celular, CRH11 e PHR2, foi claramente maior no mutante rlm1Δ/rlm1Δ em relação à estirpe WT, em mRNA de amostras de rim após 7 dias pós-infecção. Uma vez que estas proteínas são parte importante da parede celular e que in vivo as células de levedura estão sob stresse constante pelo sistema imunitário, é plausível que o mutante apresente uma expressão maior de estes genes, podendo compensar o enfraquecimento da parede celular. Em conclusão, estes resultados mostraram que o factor de transcrição Rlm1 está envolvido na estabilidade da parede celular, na interacção com o hospedeiro, sendo importante para a virulência de C. albicans e invasão durante a candidíase hematogenicamente disseminada. No seu conjunto, os objetivos propostos desta tese foram alcançados, demostrando que o gene RLM1 é um importante factor de transcrição em C. albicans, sendo essencial na remodelação da parede celular, de tal modo que o respectivo mutante é praticamente avirulento. Além disso, verificamos tambiém que nesta levadura o gene RLM1 apresenta uma elevada variabilidade genética (região repetitiva CAI), conferindo desta forma uma maior plasticidade aos isolados de C. albicans.