Caracterização da flora zimulógica de fermentos tradicionais e avaliação do seu potencial para a utilização na indústria de panificação

Abstract

A indústria da panificação utiliza normalmente estirpes seleccionadas de Saccharomyces cerevisiae como agente levedante mas, nos processos artesanais nomeadamente no fabrico da broa, usa-se um isco ou fermento que consiste numa porção de massa que se guarda da fabricação anterior e na qual se conservam e multiplicam as leveduras responsáveis pela fermentação. Dado o crescente interesse na investigação de novas leveduras de panificação, este estudo teve como principal objectivo o conhecimento e caracterização da flora de leveduras presente nos fermentos ou iscos utilizados no fabrico artesanal da broa com vista a uma possível selecção de estirpes com potencial valor para a indústria da panificação. Para tal, foram recolhidos iscos em 34 locais diferentes, predominantemente do norte do país, tendo sido isoladas 95 estirpes de leveduras e identificadas 75 de acordo com os métodos clássicos utilizados na taxonomia de leveduras. As estirpes isoladas pertenciam a nove espécies diferentes sendo as seguintes as mais representativas: S. cerevisiae, presente em cerca de 80% das amostras, Pichia membranaefaciens e espécies afins, Torulaspora delbrueckii, Issatchenkia orientalis, (presentes em cerca de 40%), P. anomala, S. kluyveri (presentes em cerca de 10%), Kluyveromyces marxianus e I occidentalis (presentes em 3%). A distribuição das leveduras nos fermentos variou de uma a quatro espécies diferentes por fermento, apresentando alguns deles mais do que uma estirpe da mesma espécie. Apenas sete dos fermentos estudados continham uma cultura pura de S. cerevisiae. Associações de duas espécies diferentes foram encontradas em 48% dos fermentos, 30% apresentavam associações de três espécies e os restantes consistiam numa mistura de quatro espécies de leveduras. Associações de S. cerevisiae e T. delbrueckii, I. orientalis e/ou P. membranaefaciens foram as mais frequentes. Todas as estirpes isoladas foram caracterizadas em relação à sua actividade "killer" tendo esta característica sido detectada em cerca de um quarto dos isolados. Entre as principais características desejáveis numa levedura de panificação contam-se uma alta actividade glicolítica, rápida fermentação da maltose, e elevadas actividades quer da invertase quer da a-glucosidase. Assim, numa segunda fase do trabalho foram seleccionadas as estirpes que apresentavam maior capacidade fermentativa da maltose e elevada produção de biomassa em diferentes meios de cultura com o objectivo de determinar a sua capacidade fermentativa nas massas e as actividades especificas da a-glucosidase e invertase quando crescidas em diferentes meios de cultura. A fim de determinar a potencial aplicação de estirpes não convencionais na indústria da panificação, além das estirpes de S. cerevisiae foram estudadas com particular atenção as de T. delbrueckii anteriormente isoladas. Estudos idênticos foram também efectuados em estirpes de S. cerevisiae isoladas de fermentos comerciais bem como em estirpes de outras proveniências, para comparação dos resultados. Quando as leveduras foram crescidas em meio Y.P.S. com 2% de sacarose verificou-se que a sua capacidade fermentativa na massa era semelhante à obtida para as estirpes comerciais, apresentando valores compreendidos entre 350 e 480 ml CO2.3h-1.10Og-1 massa. Os valores mais elevados foram obtidos para as estirpes DB 42B (IGC 5321) de T. delbrueckii e DB 56A (IGC 5320) de S. cerevisiae. A presença de 3% de NaCI no meio de crescimento estimulou a capacidade fermentativa de algumas das estirpes o mesmo acontecendo quando se adicionou 0,5% de maltose. Concentrações superiores de maltose no meio tiveram, pelo contrário, um efeito inibitório na capacidade fermentativa das leveduras. No entanto, em ambos os casos, a biomassa máxima produzida apresentou uma redução da ordem dos 25 a 30% tornando indesejável a utilização de qualquer destes compostos. No que respeita à actividade da a-glucosidase e da invertase todas as estirpes testadas apresentaram valores elevados, registando-se uma maior actividade com o aumento da concentração de maltose no meio. Verificou-se ainda que as estirpes de T. elbrueckii que isolámos (IGC 5321 [DB 42B]) e (IGC 5323 [DB 62A]) apresentaram sempre actividades mais elevadas e tanto maiores quanto maior fosse a concentração de maltose no meio. Tendo presente que os produtores de levedura para panificação procuram permanentemente estirpes que apresentem elevada capacidade fermentativa e que a mantenham, mesmo quando armazenadas a baixas temperaturas, conforme as solicitações crescentes da indústria de panificação (como o uso de massas congeladas), seleccionaram-se com base nessas características, cinco estirpes de S. cerevisiae e três de T. delbrueckii para continuação dos estudos. No que respeita ao congelamento das massas a -20°C constatou-se que apenas as duas estirpes de T delbrueckii estudadas mantiveram a capacidade fermentativa e a viabilidade celular após congelamento das massas durante 30 dias, tendo, no entanto, sido detectada uma diminuição na taxa de sobrevivência quando a massa foi sujeita a uma fermentação prévia. Após quatro dias de congelamento, a capacidade fermentativa diminuia quando se fazia aumentar o período de pré-fermentação, excepto nas duas estirpes de T. delbrueckii, que a mantinham após 15 dias de congelamento precedido de 2,5 horas de préfermentação. As duas estirpes comerciais e as duas estirpes acima referidas, exibiam um conteúdo intracelular de trealose superior a 20% (p/p). Quando comparadas todas as estirpes, nas diversas situações experimentais, os resultados obtidos ao longo deste trabalho, parecem indiciar a presença de pelo menos duas, pertencentes à espécie T delbrueckii (IGC 5321 [DB 42B]) e (IGC 5323 [DB 62A]), capazes de conservar elevada capacidade de produção de CO2, revelando simultâneamente altas concentrações de trealose intracelular e uma elevada tolerância ao congelamento, indiciando assim, um potencial valor para a panificação industrial.

In breadmaking, fermentation by yeasts is of primary importance for its leavening function and the possible contribution for the production of desirable flavour compounds. Although the baking industry generally uses Saccharomyces cerevisiae, in rural areas in Portugal bread is sometimes prepared with dough carried over from a previous making. Thus, the main objective of this work was to identify and characterize the yeast flora present in traditional bread doughs in order to select for strains of potential value for the baking industry. Thirty-four samples were randomly taken from home-made bread doughs at different locations in the country or at the same sites but from bread having distinct organoleptic characteristics and 95 strains were isolated. Only 75 were Zdentified according to conventional methods used in yeast taxonomy and nine species representative of the yeast flora were found. By far, the predominant species, isolated from about 80% of the samples was S. cerevisiae. Issatchenkia orientalis, Pichia membranaefaciens and related species and T. delbrueckii were present in ca. 40% of the samples, P. anomala, S. kluyvery, were present in about 10% and Kluyveromyces marxianus and I. occidentalis present in 3%. It is noteworthy that some doughs had very specific yeast populations, some of them having two or three strains of a single species. All the isolates have been characterized with respect to their "killer" activity. About one quarter displayed killer activity, strains of P. anomala showing the broadest spectra. Among the main characteristics desirable in a baking yeast are a high biomass production together with a rapid maltose fermentation and high fermentative capacity. Five strains of S. cerevisiae and three of T. delbrueckii, selected on the basis of these characteristics were used in this study. When these yeast strains were grown in a rich medium, Y.P.S. (with 2% of sucrose) and used in the dough, the leavening ability of the yeast cells ranged from 350 to 480m1 C02. 3h-1. 100g-1 dough. These values were very similar to those showed by the commercial strains and the highest ones belonged to a strain of S. cerevisiae (IGC 5320 [DB 56A]) and to two strains of T. delbrueckii (IGC 5321 [DB 42B] and IGC 5323 [DB 62A]). When 3% of NaCl or 0.5% of maltose were added to the growth medium, we observed that fermentative activity was enhanced but maximum biomass decresed about 20 to 30%. The activity of a-glucosidase of the selected strains was studied in the different growth media and the strains of T. delbrueckii systematically showed the highest values. These values increased with the increase of maltose concentration in the medium. In what respects invertase and in the same experimental conditions, strains of T. delbrueckii IGC 5321 [DB 42B] and IGC 5323 [DB 62A] showed the same pattern. Manufacturers of baker's yeast are in constant pursuit of strains with improved dough raising properties and capacity to retain fermentative ability during storage at low temperature in order to meet baking industry requirements such as the increasing use of frozen doughs. The same strains of S. cerevisiae and T. delbrueckii were used in this study. The objective was to test the influence of dough freezing and storage both on the leavening ability of the yeast cells and on their viability using two strains of commercial baker's yeast as a reference. Most of the studied strains displayed dough-raising capacities similar to the ones found in bakers yeasts. During storage of frozen doughs two strains of T. delbrueckii IGC 5321 [DB 42B] and IGC 5323 [DB 62A] presented approximately the same leavening ability for 30 days. Cell viability was not significantly affected by freezing, but when the dough was submitted to a bulk fermentation before beeing stored at -20°C there was a decrease in the survival ratio which depended on the yeast strain. Furthermore, the leavening ability after four days of storage decreased as the prefermentation period of the dough before freezing increased, except for strains of T. delbrueckii. These two strains retained the fermentative activity after 15 days of storage and 2.5 hours of prefermentation, despite showing a reduction of viable cells under the same conditions. The intracellular trehalose content was higher than 20% (w/w) in our of the yeasts tested: the two commercial strains of baker's yeast and the referred two strains of T. delbrueckii. However, the strains of S. cerevisiae were clearly more susceptible to freezing damages, indicating that other factors may contribute to the freeze tolerance of these yeasts. Summarizing, from the results obtained, we may conclude that two strains of T delbrueckii, when compared to all the other strains studied, kept a- strong capacity to produce C02 under all circunstances tested, showed high intracellular concentrations of trehalose and presented the highest tolerance to freezing. These properties make them candidates of potential value for the baking industry.