Evaluation of the interactions between human cells and silicone rubber surfaces modified by Atom Transfer Radical Polymerization

Abstract

Poly(dimethylsiloxane) or PDMS is one of the materials of choice to be used in implants due to some of its properties, such as low-cost, versatility, elasticity, chemical inertness, biocompatibility, non-toxicity, among others. However, PDMS also presents some drawbacks. The major limitation of PDMS is its hydrophobic nature, which makes the transferring and spreading of aqueous solutions difficult and may lead to complications in cell culture, as well as its low adhesiveness for cell attachment. The PDMS used in the current work was modified by atom transfer radical polymerization (ATRP), which is a technique used to carry out a controlled/living radical polymerization that is easy to apply and makes possible the use of different monomers and reaction media. The surface was coated with poly(ethylene glycol) methyl methacrylate (PEGMA), a polymer known for its ability to reduce biomolecules adsorption. With this coating, anti-fouling properties are expected, as well as a more hydrophilic surface. Contact angles were measured showing that the PEGMA coating turned the surface more hydrophilic. Moreover, by atomic force microscopy the surface topography was assessed. It was possible to observe that the coating possessed a high roughness, thus suggesting that ATRP is a suitable technique to create brushes in the PDMS surface. However, the contact angle variability that was found in the modified PDMS samples suggests that the technique is not reproducible. The interaction of the modified PDMS with human skin fibroblasts (HSkF) and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was assessed in order to determine the biocompatibility of the surface. To observe these interactions, an immunocytochemistry assay was used to stain the cell nuclei and the vinculin and fibronectin complexes. The stained structures were visualized with confocal microscopy. The staining of the cell nuclei made possible the estimate of the number of cells in the surface, and the formed fibronectin was also quantified. Some colorimetric assays were also performed (MTT and CV) to quantify the metabolic activity per cell, giving some insight about cell viability and adhesion. It was possible to conclude that the modified surfaces decrease cell adhesion, which is expected due to the anti-fouling properties of PEGMA. Then, if an increase in cell adhesion is desired, PDMS coated with PEGMA is not the most suitable material for vascular implants. However, due to the anti-fouling properties, a better hemocompatibility can be achieved.

O poli(dimetilsiloxano) ou PDMS é um dos materiais de eleição no desenvolvimento de implantes devido a algumas das suas propriedades, tais como baixo-custo, versatilidade, elasticidade, inércia química, biocompatibilidade, não toxicidade, entre outras. No entanto, o PDMS apresenta algumas desvantagens. A maior limitação do PDMS é a sua natureza hidrofóbica, a qual pode levar a complicações na cultura de células, bem como a sua reduzida aderência para a adesão celular. O PDMS usado neste trabalho foi previamente modificado por polimerização radicalar controlada por transferência de átomo (ATRP), que consiste numa técnica usada para levar a cabo uma polymerização radicalar controlada fácil de aplicar e que torna possível o uso de diferentes monómeros e meios de reacção. A superfície foi revestida com poli(etileno glicol) metil metacrilato (PEGMA), um polímero conhecido pela sua capacidade de reduzir a adsorção de biomoléculas. Com este revestimento, esperava-se a obtenção de uma superfície anti-adesiva e mais hidrofílica. Os ângulos de contacto foram medidos confirmando que o revestimento tornou a superfície mais hidrofílica. Adicionalmente, a topografia da superfície foi avaliada por microscopia de força atómica (AFM). Observou-se que o revestimento apresenta uma elevada rogusidade, mostrando que o ATRP é uma técnica apropriada para criar “escovas” na superfície do PDMS. No entanto, as grande variabilidade dos ângulos de contacto medidos no PDMS modificado indicam que a técnica não é reprodutível. A interacção do PDMS modificado com fibroblastos da pele humana (HSkF) e células endoteliais da veia do cordão umbilical humano (HUVECs) foi avaliada de modo a determinar a biocompatibiltidade da superfície do material em estudo. De modo a observar as interacções, utilizou-se técnicas de imunocitoquímica que permitiram marcar o núcleo celular e complexos de vinculina e fibronectina com fluorescência. As estruturas marcadas foram visualizadas com micorscopia confocal. A marcação do núcleo celular permitiu estimar o número de células na superfície, e a fibronectina formada foi também quantificada. Alguns estudos colorimétricos foram também utilizados (MTT e CV) com o intuíto de quantificar a actividade metabólica por células, fornecendo informação acerca da viabilidade e da adesão celular. Foi possível concluir que a superfície modificada diminui a adesão celular, o que era expectável devido às propriedades anti-adesivas do PEGMA. Assim sendo, se um aumento na adesão celular for desejado, o PDMS revestido com PEGMA não é o material mais apropriado para implantes vasculares. No entanto, devido às propriedades anti-adesivas, uma melhor hemocompatibilidade pode ser alcançada.