The anticarcinogenic potential of dietary natural compounds on colorectal carcinoma: effects on signalling pathways related to proliferation and cell death

Abstract

Colorectal cancer (CRC) is the third most prevalent cancer worldwide and the incidence is highly influenced by diet. Epidemiological studies have supported the idea that some dietary food components may influence the risk of CRC through modulation of several biological processes, including proliferation, survival and cell death. The PI3K/Akt and MAP kinases (ERK, JNK and p38) pathways are frequently altered in CRC and components of these pathways are important molecular targets for CRC treatment. Moreover, the apoptotic and non-apoptotic pathways of cell death have been shown good targets for anticancer drugs. The aim of the thesis was to identify potentially anticarcinogenic natural compounds and characterize their effects on signaling pathways related to proliferation and cell death, in CRC cell lines. The role of these natural compounds in combination with 5-fluorouracil (5-FU) was also evaluated. Initially, the anticarcinogenic effect of some water extracts (prepared as a tea) in two human colon carcinoma-derived cell lines, HCT15 and CO115 was studied. In chapter II, we demonstrated the anticarcinogenic activity of Salvia fruticosa (SF) and Salvia officinalis (SO), that seems to be due, at least partially, to the inhibition of the MAPK/ERK pathway, through effects upstream of BRAF. This effect was not due to rosmarinic acid (RA), the major phenolic compound present in these sage plants. In a subsequent study (chapter III), we showed the potential of Hypericum androsaemum (HA) in inhibiting cell proliferation and inducing apoptosis, at least in part, through inhibition of mutant BRAF and PI3K/Akt pathway, as well as, by the induction of p38 and JNK MAP kinases. As in the case of RA also here the main phenolic compound present in HA extract, chlorogenic acid, tested alone did not show any of those effects. Taking into account the previous observations, we further evaluated the potential anticarcinogenic effects of quercetin (Q), luteolin (L) and ursolic acid (UA) in CRC cells. These phenolic compounds (Q and L) and triterpenoid (UA) are present (or appear as derivates) in the water extracts previously used, and have been demonstrated to modulate many steps of the carcinogenic process. In chapter IV, we found that Q and L have antiproliferative and proapoptotic effects that seem to be due, at least in part, to effects on KRAS through regulation of both MAPK/ERK and PI3K pathways. UA demonstrated anticarcinogenic effects by acting on PI3K. In chapter V, we performed a combined study of Q, L and UA with the most common chemotherapeutic agent used in CRC treatment, 5-FU. Resistance to 5-FU arises, especially in tumors with p53 mutations, make combinations with other drugs a necessary strategy to increase 5-FU’s efficacy. In the first part of this study, we demonstrated that Q and L enhanced 5-FU-induced apoptosis and a synergistical effect was observed with Q in the p53 wild type CO115 cells. Q may increase 5-FU-induced apoptosis by modulating the mitochondrial pathway dependent on p53. In the second part, UA was observed to synergistically enhance 5-FU-induced apoptosis in the p53 mutant HCT15 cells. The increase on apoptosis was not dependent on caspases and it was almost completely abrogated by an inhibitor of JNK, suggesting that in these cells UA induces apoptosis through JNK activation. Moreover, the increase of total cell death and the accumulation of LC3, induced by UA, were also dependent on JNK activation. In order to explore the remarkable induction of cell death by UA, which was not all explained by increased apoptosis, we verified the involvement of UA in the autophagic process (chapter VI). Interestingly, we found that UA inhibits autophagy in HCT15 cells at the maturation step, since no fusion events between lysosomes and autophagosomes were detected. Taking advantage of techniques established for MCF-7 breast cancer cells, including the tandem fluorescent construct tagged with LC3 and the measurement of LC3 turnover using a luciferase-based real time assay, the results above were confirmed. Furthermore, UA increased lysosomal membrane permeabilization and decreased the total lysosomal hydrolases activities, indicating a possible impact on lysosomal biogenesis and/or a direct destabilizing effect on lysosomal membranes. In conclusion, this work adds SF, SO and HA to the list of potential plants to use in CRC dietary strategies, as well as, the natural compounds Q, L and UA present in human diet. These natural compounds control CRC progression by modulating important molecular targets, as well as, by enhancement of 5-FU efficiency. UA was the most promising compound, destabilizing the lysosomes and, consequently, inhibiting autophagy, which could sensitize cells to death and thus, may have a possible interest as adjuvant in cancer therapy.

O cancro colorectal (CRC) é o terceiro cancro mais comum a nível mundial estando a sua incidência fortemente influenciada pela dieta. Estudos epidemiológicos revelam que compostos presentes na dieta podem influenciar o risco de CRC, modulando vários processos biológicos, incluindo a proliferação, sobrevivência e morte celular. As vias de sinalização PI3K/Akt e MAP kinases (ERK, JNK e p38) estão frequentemente alteradas no CRC e por isso, componentes destas vias constituem alvos moleculares importantes para o seu tratamento. Além disso, as vias apoptóticas e não-apoptóticas de morte celular têm demonstrado ser bons alvos de drogas anticarcinogénicas. A presente tese teve como objectivo identificar compostos naturais com potencial anticarcinogénico e caracterizar os seus efeitos ao nível das vias relacionadas com proliferação e morte celular em linhas de CRC. O papel destes compostos em combinação com o 5-Fluorouracilo (5-FU) foi também abordado. Inicialmente, os efeitos anticarcinogénico de alguns extractos aquosos (preparados como chás) foram estudados em duas linhas celulares humanas de carcinoma do cólon, HCT15 e CO115. No capítulo II, demonstrou-se a actividade anticarcinogénica das plantas Salvia fruticosa (SF) e Salvia officinalis (SO), em que o seu efeito pareceu deverse, pelo menos em parte, à inibição da via MAPK/ERK, através de efeitos a montante do BRAF. O ácido rosmarínico (RA), composto fenólico maioritário presente nas Salvias não foi o responsável pelos efeitos observados. No capítulo III, demonstrou-se que o extracto aquoso de Hypericum androsaemum (HA) é capaz de inibir a proliferação celular e induzir a apoptose, pelo menos em parte, por inibir o BRAF mutado e a via PI3K/Akt, assim como, por induzir as MAP kinases p38 e JNK. Tal como no caso do RA, também o composto fenólico maioritário presente no extracto HA, o ácido clorogénico, testado sózinho, não mostrou nenhum destes efeitos. Tendo em conta os resultados anteriores, foi-se de seguida avaliar o potencial anticarcinogénico da quercetina (Q), luteolina (L) e ácido ursólico (UA). Estes compostos fenólicos (Q e L) e triterpenoide (UA) encontram-se presentes (ou aparecem como derivados) nos extractos aquosos anteriormente estudados, e têm a capacidade em modular várias etapas do processo carcinogénico. No capítulo IV, observou-se o efeito antiproliferativo e pró-apoptótico da Q e L, que foi relacionado, pelo menos em parte, com efeitos no KRAS regulando as vias PI3K e MAPK/ERK. O efeito anticarcinogénico do UA foi observado ao nível do PI3K. No capítulo V, o efeito combinado da Q, L e UA com 5-FU, agente quimioterapêutico mais usado no tratamento do CRC, foi avaliado. O aumento das resistências ao 5-FU, especialmente em tumores com mutações no p53, leva a estratégias de combinações com outras drogas necessárias para aumentar a eficácia do 5-FU. Na primeira parte deste estudo, a Q e a L aumentaram a apoptose induzida pelo 5-FU, e um efeito sinergético foi obtido para a Q nas células CO115 com p53 normal. A Q provavelmente aumentou a apoptose induzida pelo 5-FU através da modulação da via mitocondrial dependente do p53. Na segunda parte, observou-se que UA sinergeticamente aumentou a apoptose induzida pelo 5-FU em células HCT15 com p53 mutado. O aumento da apoptose não foi dependente das caspases e foi quase completamente inibido por um inibidor da JNK, sugerindo que nestas células o UA induz apoptose via activação da JNK. Além disso, o aumento da morte celular total e a acumulação do LC3, induzidos pelo UA, foi também dependente da activação da JNK. Por fim, para explorar o efeito marcante da indução da morte celular pelo UA, na qual não foi totalmente explicado pelo aumento da apoptose, foi estudado o involvimento do UA no processo autofágico (capítulo VI). Interessantemente, verificou-se que o UA inibiu a autofagia nas células HCT15 ao nível da maturação, uma vez que não foi detectado fusão entre lisossomas e autofagossomas. Estes resultados foram confirmados tirando vantagem de técnicas estabelecidas para a linha MCF-7 de cancro da mama, como a construção fluorescente tandem ligado ao LC3 e a medição do turnover do LC3 usando o ensaio de luciferase em tempo real. Adicionalmente, observou-se que UA aumentou a permeabilidade da membrana lisossomal e diminuiu a actividade total das hidrolases lisossomais, indicando um possível impacto na biogénese lisossomal e/ou uma destabilização directa na membrana dos lisossomas. Em conclusão, este trabalho adiciona SF, SO e HA, à lista de potenciais plantas a usar em estratégias alimentares contra o CRC, assim como a Q, L e UA presentes na dieta. Estes compostos naturais controlam a progressão do CRC modulando importantes alvos moleculares e aumentando a eficiência do 5-FU. O UA foi o composto mais promissor, destabilizando os lisossomas e, consequentemente, inibindo a autofagia, e por isso, possuindo elevado interesse como adjuvante na terapia do cancro.