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https://hdl.handle.net/1822/10265
Título: | Novel biodegradable drug delivery systems for the controlled release of growth factors in bone healing and tissue engineering |
Autor(es): | Bessa, Paulo C. |
Orientador(es): | Reis, R. L. Casal, Margarida |
Data: | 21-Dez-2009 |
Resumo(s): | Tissue engineering has emerged recently as a promising alternative in cases of tissue loss or
organ failure by overcoming the expression of different genes, stimulated during osteogenic differentiation. No cytotoxicity
was observed as inferred by cell viability assays.
Different materials have been proposed as carriers for BMPs. Carriers are used to increase the
lifetime, stability and bioactivity of the BMPs and release these growth factors in both timely
and site-specific ways. Silk fibroin and an elastin-like polypeptide were investigated as
potential microparticle systems for the sustained delivery of different recombinant BMPs.
Silk fibroin microparticles were produced by dropwise addition of ethanol. BMP-2, BMP-9 or
BMP-14 were loaded into the particles and could be released in a sustained way in a period of
two weeks, as evaluated by ELISA and quantitative dot-blot. The fibroin particles did not show
any significant in vitro cytotoxicity. The fibroin particles loaded with BMP-2 were able to
induce high levels of ALP activity and osteogenic mineralization in C2C12 cells. In rats, the
BMP-2 loaded particles were implanted subcutaneously and ectopic bone formation was
observed by live microCT and histology, four weeks post-implantation.
Elastin-like nanoparticles, created by thermoresponsive self-assembly, were also explored for a
combined release of BMP-2 and BMP-14. Both growth factors were encapsulated with a high
efficiency, and could be delivered in a combined and sustained way, retaining their bioactivity,
as observed in C2C12 cells.
The results obtained in the thesis demonstrate that the methodologies that were developed
may result in novel therapeutical applications in the biomaterial and regenerative medicine
fields.problems of rejection and donor scarcity. Tissue engineering
attempts to mimetize the body mechanisms of healing. By combining cells from the patient,
growth factors and supportive scaffolds, it seeks to achieve the total regeneration of tissues.
Bone morphogenetic proteins (BMPs) are cytokines with important roles during
embryogenesis, and with strong ability to induce formation of new bone and cartilage. These
growth factors have been used as powerful osteoinductive components in several tissue
engineering products for bone grafting.
In this context, the main objectives proposed for this thesis were:
i. To develop a strategy to produce, purify and characterize high amounts of recombinant
BMPs.
ii. To evaluate the potential of new natural-origin biodegradable polymers for delivery of
BMPs.
Currently, most BMPs are obtained from mammalian cell cultures in low yields or from
bacteria inclusion bodies after time-consuming refolding steps. Aiming to circumvent the
disadvantages of the previously reported methods, we have developed a novel approach for
the production of high amounts of pure recombinant BMPs. The mature domains of human
BMPs were cloned in pET-25b vector in Escherichia coli. This vector contained a leader
sequence for secretion of the recombinant protein into the periplasm, where conditions are
more adequate for the formation of the dimer conformation of BMPs. The method was
applied for producing human BMP-2, BMP-4, BMP-9, BMP-10, BMP-11 and BMP-14.
Overexpression of the BMPs was achieved and scaled-up in a bioreactor. The BMPs were
purified with affinity chromatography by tagging the protein with an histidine tag, resulting in
significantly large amounts of pure protein. In murine myoblast C2C12 cells and in primary
cultures of human fat-derived adult stem cells, these growth factors showed bioactivity. This
was observed by the induction of alkaline phosphatase activity and the upregulation of the A Engenharia de Tecidos emergiu recentemente como uma alternativa promissora nos casos de perda ou falha da função de um órgão ou tecido, ultrapassando os problemas de rejeição imunitária e da escassez de dadores. Através da combinação do uso de células do paciente, de factores de crescimento e de estruturas de suporte, espera-se a total regeneração dos tecidos. As proteínas morfogenéticas do osso (BMPs) são citocinas com funções importantes durante a embriogénese, possuindo uma forte capacidade de induzir a formação e regeneração de osso e de cartilagem. Estes factores de crescimento têm sido usados como potentes componentes osteoinductores de diversos produtos de engenharia de tecidos para aplicações ósseas. Neste contexto, os objectivos principais propostos nesta tese são: i. Desenvolver uma estratégia para produzir, purificar e caracterizar quantidades significativas de BMPs recombinantes. ii. Avaliar o potential de novos sistemas naturais de polímeros biodegradáveis para a libertação de BMPs. De momento, a maioria das BMPs são obtidas a partir de culturas de células de mamífero, produzidas em pequenas quantidades, ou ainda a partir de corpos de inclusão em bactéria, após protocolos morosos de renaturação. Com o objectivo de ultrapassar estas desvantagens, foi desenvolvida uma nova metodologia para a produção de largas quantidades de BMPs puras. O domínio funcional das BMPs humanas foi clonado no vector pET-25b em Escherichia coli. Este vector contém uma sequência sinal que permite a secreção da proteína recombinante para o periplasma, onde o ambiente favorece a formação dos dímeros de BMPs. Este método foi aplicado para a produção de BMP-2, BMP-4, BMP-9, BMP-10, BMP-11 e BMP-14 humanas. A sobreexpressão de BMPs foi atingida e aplicada à larga escala, em bioreactor. As BMPs foram purificadas por cromatografia de afinidade para uma cauda de histidinas, resultando em quantidades significativamente elevadas de proteína pura. Estes factores de crescimento demonstraram bioactividade em células mioblásticas C2C12 e em culturas primárias de células estaminais adultas obtidas de tecido adiposo, observada através da indução da actividade da fosfatase alcalina e da expressão de genes relacionados com a diferenciação osteogénica. Não foi observada citotoxicidade, como demonstraram testes de viabilidade celular. Diferentes materials têm sido propostos como suportes de libertação de BMPs. Estes auxiliam o aumento da estabilidade e bioactividade das BMPs, libertando estes factores de crescimento de maneira específica espacial e temporalmente. A fibroína da seda e um polipéptido baseado em elastina foram investigados como sistemas microparticulados para libertação controlada de diferentes BMPs recombinantes. Micropartículas de fibroína da seda foram produzidas por adição gota-a-gota com etanol. BMP-2, BMP-9 ou BMP-14 foram imobilizadas nas partículas e poderam ser libertadas de modo contínuo durante um período de duas semanas, como demonstrou a análise por ELISA e dot-blot semi-quantitativo. As partículas de fibroína não demonstraram citotoxicidade in vitro. Partículas carregadas com BMP-2 foram capazes de induzir elevados níveis de actividade de ALP e mineralização osteogénica na linha celular C2C12. Em ratos, as partículas com BMP-2 foram implantadas subcutaneamente e foi observada formação ectópica de osso, através de microCT e análise histológica, quatro semanas após implantação. Nanopartículas baseadas em elastina foram também estudadas para a libertação combinada de BMP-2 e BMP-14, criadas por auto-organização termosensível. Ambos os factores de crescimento foram encapsulados com eficiências elevadas, e poderam ser libertados de maneira controlada, retendo a sua bioactividade, como observado em células C2C12. Os resultados descritos nesta tese demonstram que as metodologias que foram desenvolvidas podem resultar em novas aplicações terapéuticas nas áreas dos biomateriais e da medicina regenerativa. |
Tipo: | Tese de doutoramento |
Descrição: | Tese de doutoramento em Ciência e Tecnologia de Materiais (área de Engenharia de Tecidos e Materiais Híbridos) |
URI: | https://hdl.handle.net/1822/10265 |
Acesso: | Acesso aberto |
Aparece nas coleções: | DEP - Teses de Doutoramento |
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