Isolation and characterization of phages for enterotoxigenic E. coli

Abstract

A ocorrência de diarreias está relacionada com infeções causadas por Escherichia coli, sendo a E. coli enterotoxigénica (ETEC) frequentemente identificada em casos de diarreia do viajante e de diarreia pós-desmame (PWD) em suínos. A vasta utilização de antibióticos para tratar infeções de ETEC em animais alertou as autoridades de saúde pública devido ao desenvolvimento bacteriano de resistência a múltiplos medicamentos. Assim sendo, é urgente encontrar soluções eficazes para substituir os antimicrobianos convencionais. Os bacteriófagos (fagos), vírus que infetam bactérias, são uma abordagem de tratamento promissora devido ao seu potencial para tratar infeções bacterianas. No entanto, algumas bactérias resistem à infeção fágica através de sistemas de defesa anti-fagos (APDS). O presente estudo tem como objetivo isolar e identificar fagos que possam contornar as principais APDS da ETEC, alargando o seu alcance lítico e possibilitar a sua utilização na terapia. Foi possível isolar três fagos, EcoSus34, EcoSus42 e EcoSus65. Atribuídos à classe Caudoviricetes, os fagos apresentam duas morfologias distintas: EcoSus34 e o EcoSus65 são myovirus e o EcoSus42, podovirus. Através de um processo de caraterização, todos os fagos revelaram um baixo espetro de hospedeiros e, num único caso, uma baixa eficiência de infeção. A análise genómica dos fagos indicou que todos exibem características típicas de ciclos de vida exclusivamente líticos e não possuem quaisquer proteínas associadas à virulência. No entanto, o EcoSus65 destacou-se como sendo o único fago que codificou uma possível contra-defesa para os APDS, nomeadamente a molécula Dmd, que interfere com o rácio toxina-antitoxina (TA) da bactéria. A ETEC H10407 (do GenBank) e a EC43 foram submetidas a anotação funcional e tinham um total de nove e quatro proteínas relacionadas com a APDS, respetivamente. Entre as proteínas identificadas, a incidência de sistemas TA foi maior, mas as bactérias também codificaram sirtuins associados à defesa (DSR), sistemas de exclusão de superinfeção (Sie) e sistemas de restrição modificação (RM). Além disso, a presença de um mecanismo capaz de causar a morte celular após a adsorção fágica foi verificada in vitro, utilizando as estirpes EC40 e EcoSus42 da ETEC. A um nível geral, o trabalho desenvolvido confirmou a importância da ocorrência de APDS em estirpes bacterianas e a urgência de encontrar fagos que consigam ultrapassar os mecanismos de defesa, como o EcoSus65, sendo o mesmo selecionado como o candidato mais adequado para potenciais aplicações terapêuticas.

Frequent occurrences of diarrheal illnesses are often related to infections caused by various pathotypes of Escherichia coli, with enterotoxigenic E. coli (ETEC) being the most frequently identified pathogen in cases of travelers’ diarrhea and post-weaning diarrhea (PWD) in pigs. The massive use of humans’ last resort antibiotics to treat ETEC infections in animals caught the attention of public health authorities due to bacteria's ability to develop multidrug resistance. Therefore, it became urgent to find efficient solutions to replace conventional antimicrobials. Bacteriophages (phages), viruses that specifically infect bacteria, represent a promising treatment approach because of the enormous potential to overcome bacterial infections. Nevertheless, some bacteria can resist to phage infection using a wide range of anti-phage defense systems (APDS). The present study aims to isolate and identify phages that can effectively address the primary APDS of ETEC, widening their range of lytic activity for possible use in therapy. Firstly, the isolation of three ETEC-infecting phages EcoSus34, EcoSus42 and EcoSus65 was successfully accomplished. As part of Caudoviricetes class, the phages represented two distinct morphotypes: EcoSus34 and EcoSus65 are myovirus and EcoSus42, podovirus. Through a characterization process, among a selection of 95 ETEC strains, all phages revealed a low host range and, in a single case, a low efficiency of infection. The phages’ genomic analysis indicated that all exhibit typical features of exclusively lytic life cycles and did not have any virulence-associated proteins. However, EcoSus65 stood out as the single phage that encoded a possible counter-defense for bacterial APDS, this being a Dmd molecule that interferes with toxin-antitoxin (TA) bacterial ratio. ETEC H10407 (from GenBank) and EC43 underwent functional annotation and had total of nine and four proteins possibly related to APDS, respectively. Among these identified proteins, the incidence of TA systems was higher, but the bacteria also encoded defense-associated sirtuins (DSR), superinfection exclusion (Sie) systems and restriction-modification (RM) systems. Additionally, the presence of a mechanism capable of causing cell death upon phage adsorption was supported in vitro, using ETEC strain EC40 and EcoSus42. Overall, the work developed confirmed the importance of APDS occurrence in bacterial strains and the urgence of finding phages that can overcome defense mechanisms, such as EcoSus65, being selected as most suitable candidate for potential therapeutic applications.