Isolation and characterization of phages targeting the phytopathogenic bacteria of Actinidia

Abstract

Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) is the causal agent of bacterial canker in kiwifruit (Actinidia deliciosa), leading to severe symptoms in plants and consequent considerable production and financial losses. Current methods for controlling this disease rely on the use of copper-based products and, in countries outside the European Union, in the use of antibiotics. These products, besides being considered phytotoxic, can lead to the spread of resistance to both copper and antibiotics. With the increasing need to obtain safe and effective biocontrol strategies against this pathogen, this study focused on the isolation and characterization of (bacterio)phages for the control of Psa. A collection of Psa strains was characterized by PCR and phenotypical analysis, such as Biolog GEN III and phages were isolated from branches, buds, leaves, petals, sepals, and stamens from kiwifruit plants in orchards in the North of Portugal. Phages were isolated using the enrichment procedure with Psa strains CFBP 7286 and P84 as possible hosts, and the lytic spectra of 6 selected phages were tested against the Psa collection. Two phages displayed broader host ranges (between 71% and 84% of efficacy among Psa strains) were selected for further analysis. Phage stability was studied at different temperatures (-20º to 60ºC), pH (1-13) and UV light, and it was observed that the two phages were stable between -20ºC and 50ºC, pH range of 3 to 11 and UV light at 366 nm up to 180 min. The morphological characterization of phages was done by Transmission Electron Microscopy and genome sequencing. In vitro efficacy assays showed that phage 177T was able to reduce the number of CFUs after 4h of inoculation and keeping the bacterial load at low levels for up to 24h post-infection with MOI=1. Phage VC3 was able to decrease the OD600 through 24h. In a preliminary test, the infection of Psa and phage in kiwi plants was examined, and the evolution of symptoms after 12 days of inoculation with just Psa was observed. One phage has been sequenced and confirmed to be lysogenic, prophages might be employed to combat illnesses caused by harmful bacteria. In this study was possible to highlight the potential of phages as promising biocontrol agents against Psa, that could be used in the future to replace copper compounds and antibiotics.

Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) é o agente da doença do cancro bacteriano da Actinidea (Actinidia deliciosa), e é responsável por perdas consideráveis produtivas e financeiras, fazendo com que as plantas sofram sintomas severos. Os métodos atuais de controlo da doença contam com o uso de produtos à base de cobre e, em países fora da União Europeia, com o uso de antibióticos. Esses produtos, além de serem considerados fitotóxicos, podem levar ao aparecimento da resistência tanto ao cobre quanto aos antibióticos. Com a necessidade cada vez maior de se obterem estratégias biológicas, seguras e eficazes contra esse patogénio, este estudo abordou o isolamento e a caracterização de bacteriófagos para o controlo de Psa. Uma colecção de estirpes de Psa foi caracterizada por métodos moleculares e análises fenotípicas, como Biolog GEN III. Os fagos foram isolados de ramos, botões, folhas, pétalas, sépalas e estames de plantas de kiwi em pomares no Norte de Portugal usando o procedimento de enriquecimento com as estirpes Psa CFBP 7286 e P84 como possíveis hospedeiros, e o espectro lítico de 6 fagos selecionados foram testados contra a coleção de Psa. Dois fagos exibiram eficácia entre estirpes de maneira mais ampla (entre 71% e 84% de eficácia entre as estirpes de Psa) e foram selecionados para determinar análises posteriores. A estabilidade dos fagos foi estudada em diferentes temperaturas (-20º a 60ºC), pH (1-13) e luz UV, e foi observado que os dois fagos eram estáveis entre -20ºC e 50ºC, de pH de 3 a 11 e luz UV a 366 nm até 180 min. A caracterização morfológica foi feita por Microscopia Eletrônica de Transmissão e procedeu-se à sequenciação do genoma. Ensaios de eficácia in vitro mostraram que o fago 177T foi capaz de reduzir o número de UFC após 4h de inoculação e manter a carga bacteriana em níveis baixos por até 24h pós-infecção com MOI = 1. O fago VC3 foi capaz de diminuir a OD600 ao longo de 24h. Num teste preliminar, foi examinada a infeção de Psa e fago em plantas de kiwi, e foi observada a evolução dos sintomas após 12 dias de inoculação apenas com Psa. Neste estudo apenas um fago foi sequenciado e confirmado como lisogénico, os profagos podem ser benéficos para combater doenças prejudiciais causadas por bactérias patogénicas. Neste estudo foi possível destacar o potencial dos fagos como agentes de biocontrolo promissores contra Psa, que podem ser usados no futuro para substituir compostos de cobre e antibióticos.