Development of a biosensor based on plastic antibodies for the isolation and detection of extracellular vesicles

Abstract

As vesículas extracelulares são nanovesículas libertadas pelas células que participam na comunicação intercelular, afetando os processos fisiológicos e patológicos. Estas vesículas transportam inúmeras biomoléculas, incluindo ácidos nucleicos, proteínas e lípidos e, por isso, têm sido amplamente estudadas como novos biomarcadores em biópsias líquidas, podendo a sua identificação ser utilizada para deteção precoce de doenças através de diagnósticos minimamente invasivos e terapias de última geração. No entanto, a heterogeneidade das vesículas extracelulares e a complexidade dos fluídos biológicos requerem o desenvolvimento de métodos mais eficientes para o seu isolamento e deteção. Nesse sentido, o principal objetivo deste trabalho é apresentar uma nova tecnologia baseada em polímeros molecularmente impressos para o isolamento destas vesículas. Estes materiais poliméricos sintéticos são estáveis, fáceis de produzir, e contêm locais de reconhecimento específicos para o composto alvo, permitindo a sua ligação seletiva e subsequente deteção com alta sensibilidade. Neste trabalho, foi desenvolvido um novo polímero fotónico impresso molecularmente como sensor para isolamento e deteção de vesículas extracelulares. O sensor proposto tem por base a fabricação de uma estrutura fotónica formada por esferas coloidais integrada num hidrogel impresso. A proteína CD9 presente na superfície das vesículas foi utilizada como molécula de impressão e as propriedades analíticas do sensor com base no sinal ótico foram inicialmente analisadas quanto ao reconhecimento da CD9. O sensor apresentou uma resposta linear entre 25 pg mL-1 e 2344 pg mL-1 de CD9 e um limite de deteção de 19 pg mL-1 de CD9 em soro humano, para além de ter demonstrado seletividade para a CD9 em comparação com outros biomarcadores proteicos existentes nas vesículas extracelulares. Além disso, o sensor foi capaz de detetar vesículas extracelulares em soro humano, na gama de 6,85 ×101 µL-1 – 6,85 ×105 µL-1 . O material sensor desenvolvido é bastante promissor, para a deteção e o isolamento de vesículas extracelulares, oferecendo vantagens do ponto de vista de custo e sensibilidade, relativamente às técnicas de isolamento convencionais.

Extracellular vesicles are nanoscale vesicles released by cells that participate in intercellular communication, and thus affect physiological and pathological processes. Due to their biomolecular cargo, composed of nucleic acids, proteins, and lipids, extensive studies have been pursued on extracellular vesicles as novel biomarkers in liquid biopsies. Therefore, the ability to identify them is a powerful tool for early detection of diseases through minimally invasive diagnostics and next-generation therapies. However, due to the heterogeneity of extracellular vesicles and the complexity of biofluids, more efficient methods for their isolation and detection need to be developed. In this regard, the main objective of this thesis is to introduce a novel technology for the isolation of extracellular vesicles based on molecularly imprinted polymers. These synthetic polymeric materials are stable, easy to produce, and contain specific recognition sites for the target compound, allowing their selective binding and detection with high sensitivity. Herein, a novel molecularly imprinted photonic polymer sensor was developed for isolation and detection of extracellular vesicles. The sensor design is based on the fabrication of an imprinted hydrogel integrating a photonic structure formed by the self-assembly of colloidal spheres. The CD9 protein present on the surface of the vesicles was used as imprinting molecule and the analytical properties of the sensor based on the optical signal were first assayed for CD9 recognition. The sensor displayed a linear response from 25 pg mL-1 to 2344 pg mL-1 of CD9 and a limit of detection of 19 pg mL-1 of CD9 in human serum, demonstrating also to be selective for CD9 when compared to other protein biomarkers present in extracellular vesicles. In addition, the sensor detected extracellular vesicles in the range of 6.85 ×101 µL- 1 – 6.85 ×105 µL-1 in human serum. Overall, the developed sensing material based on molecular imprinting technology is a promising cost-effective and simple alternative to conventional isolation procedures as a sensitive method for the detection and isolation of extracellular vesicles.