Design and validation of an alternative molecular method using peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization (PNA FISH) for the detection of Campylobacter spp. in food samples

Abstract

Foodborne diseases are an important cause of morbidity and mortality, and a significant impediment to socioeconomic development worldwide. Among the foodborne bacterial pathogens, Campylobacter is recognized as the leading cause of foodborne illness. Several methods, from traditional culture to advanced molecular techniques, are currently used to prevent contaminated food from reaching consumers. Peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization (PNA FISH) is a new molecular technique with some application to food safety; but no method has been described for Campylobacter detection in foods. PNA FISH is a simple, fast and highly sensitive detection technique that uses fluorescence-labelled probes targeting specific regions of ribosomal RNA. Although the high reliability of this technique, a pre-enrichment procedure of food samples is still necessary to increase target pathogen concentration to detectable levels. In this way, the work presented in this thesis had two main objectives: to optimize an enrichment step for the detection of Campylobacter in food samples by PNA FISH; and then to evaluate the developed method according to the requirements necessary to obtain AOAC Performance Tested Method SM (PTM) certification. For this purpose, fresh raw broiler meat and fresh raw ground pork samples artificially contaminated with Campylobacter jejuni and Campylobacter coli, respectively, were analysed using different enrichment broths and different incubation times. After selecting the most suitable enrichment step for application in the PNA FISH methodology, the various tests required by the AOAC Research Institute for PTM certification were performed. Initially, Campylobacter species were found to be severely affected by storage at low temperatures and, therefore, the reduction of cultivability in these conditions was estimated to adjust the pathogen concentration. Then, 48-hour enrichment in Bolton broth resulted in a higher number of positive samples and proved to be essential to achieve a detection limit of 1 CFU/25 g for both food matrices. In order to reduce the autofluorescence conferred by some compounds of food matrices, a new step involving centrifugation (10,000 g) and resuspension in 0.1% Tween-80, was introduced before the standard PNA FISH procedure. In the certification tests, the inclusivity and exclusivity assay revealed a sensitivity of 92.0% and a specificity of 96.9% for the developed method. In the food matrix comparison test, the PNA FISH method showed a similar performance to the ISO 10272-1:2017 reference method. The tests of product consistency and stability, and kit variation have also showed the reliability of the method. On the other hand, the ruggedness test has shown that PNA FISH conditions should be controlled very strictly as small variations can affected significantly the performance of the method. The results presented in this work are, therefore, a confirmation that the developed PNA FISH method for the detection of Campylobacter spp. in food samples is suitable for PTM certification.

As doenças transmitidas por alimentos são uma causa importante de morbidade e mortalidade, e um impedimento significativo para o desenvolvimento socioeconómico em todo o mundo. Entre os patógenos bacterianos transmitidos por alimentos, Campylobacter é reconhecida como a principal causa de doenças transmitidas por alimentos. Vários métodos, desde de técnicas de cultura tradicional até técnicas moleculares avançadas, são utilizados atualmente para evitar que alimentos contaminados cheguem aos consumidores. A hibridização in situ fluorescente de ácido nucleico peptídico (PNA FISH) é uma nova técnica molecular com alguma aplicação na segurança alimentar; mas nenhum método foi descrito para a deteção de Campylobacter em alimentos. PNA FISH é uma técnica de deteção simples, rápida e altamente sensível que usa sondas marcadas com fluorescência visando regiões específicas de RNA ribossómico. Apesar da alta credibilidade desta técnica, um procedimento de pré-enriquecimento das amostras alimentares ainda é necessário para aumentar a concentração de patógeno alvo até níveis detetáveis. Desta forma, o trabalho apresentado nesta tese teve dois objetivos principais: otimizar um passo de enriquecimento para a deteção de Campylobacter em amostras alimentares por PNA FISH; e depois avaliar o método desenvolvido de acordo com os requisitos necessários para obter a certificação AOAC Performance Tested MethodSM (PTM). Para o efeito, foram analisadas amostras frescas de carne de frango cru e carne de porco cru moída artificialmente contaminadas com Campylobacter jejuni e Campylobacter coli, respetivamente, utilizando diferentes meios de enriquecimento e diferentes tempos de incubação. Depois de selecionar o passo de enriquecimento mais adequado para aplicação na metodologia PNA FISH, foram realizados os vários testes exigidos pelo Instituto de Pesquisa AOAC para certificação PTM. Inicialmente, verificou-se que as espécies de Campylobacter são severamente afetadas pelo armazenamento a baixas temperaturas e, portanto, a redução da cultivabilidade nessas condições foi estimada para ajustar a concentração de patógenos. Em seguida, o enriquecimento de 48 horas no caldo de Bolton resultou num maior número de amostras positivas e revelou-se essencial para atingir um limite de deteção de 1 CFU/25 g para ambas as matrizes alimentares. A fim de reduzir a autofluorescência conferida por alguns compostos das matrizes alimentares, foi introduzido um novo passo envolvendo uma centrifugação (10 000 g) e ressuspensão em 0.1% de Tween-80 antes do procedimento padrão PNA FISH. Nos testes de certificação, o ensaio de inclusividade e exclusividade revelou uma sensibilidade de 92.0% e uma especificidade de 96.9% para o método desenvolvido. No teste de comparação da matriz de alimentos, o método PNA FISH mostrou desempenho semelhante ao método de referência ISO 10272-1: 2017. Os testes de consistência e estabilidade do produto e variação do kit também mostraram a credibilidade do método. Por outro lado, o teste de robustez mostrou que as condições de PNA FISH devem ser controladas de forma muito estrita, pois pequenas variações podem afetar significativamente o desempenho do método. Os resultados apresentados neste trabalho são, portanto, uma confirmação de que o método PNA FISH desenvolvido para a deteção de Campylobacter spp. em amostras alimentares é adequado para a certificação PTM.