Investigation of heteroresistance towards antibiotics by biofilm-associated bacteria

Abstract

As infeções hospitalares por bactérias resistentes constituem uma ameaça à saúde humana, causando cerca de 25 mil mortes por ano. A mortalidade associada a estas infeções tem sido ligada à formação de biofilmes e ao desenvolvimento de resistência antimicrobiana, nomeadamente heteroresistência, em que as bactérias podem ser selecionadas durante terapia com antibióticos, levando à falha terapêutica. Assim, é importante entender estes fenómenos desenvolvidos por muitas bactérias. Os objetivos deste trabalho foram: i) verificar e comparar a capacidade de formação de biofilmes por Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae e Acinetobacter baumannii em consórcios simples e polimicrobianos; ii) estabelecer e comparar a resposta de células planctónicas e de biofilmes destas bactérias a antibióticos convencionais; iii) verificar a ocorrência de heteroresistência em populações planctónicas e em biofilmes. A capacidade de formação de biofilme e a viabilidade das populações simples e mistas foi obtida por cristal violeta (CV) e contagem de unidades formadoras de colónias (CFU). Staphylococcus aureus apresentou o maior número de células viáveis e maior produção de biomassa. Foi observada uma relação de antagonismo em populações mistas de S. aureus e P. aeruginosa. Uma diminuição na produção de biomassa por P. aeruginosa foi observada quando esta foi co-cultivada com K. pneumoniae e A. baumannii, sugerindo um mecanismo de proteção desenvolvido por estas bactérias contra P. aeruginosa. Os padrões de susceptibilidade das células planctónicas e de biofilme foram determinados pelo teste da microdiluição. As culturas planctónicas de P. aeruginosa, A. baumanni e K. pneumoniae mostraram um comportamento resistente à colistina, exibindo um valor de concentração mínima inibitória (MIC) duas vezes maior do que os MICs propostos pela EUCAST. Os padrões de susceptibilidade dos biofilmes revelaram um aumento significativo da resistência antimicrobiana em comparação com as células planctónicas. A ocorrência de heteroresistência foi averiguada através de análise de perfil populacional (PAP). Foi detetada heteroresistência nas culturas planctónicas de K. pneumoniae e S. aureus, para a colistina e a vancomicina, respetivamente. Nenhuns estudos anteriores reportaram populações de K. pneumoniae capazes de crescer até 16 mg/L de colistina. Não foram detetadas subpopulações heteroresistentes em células de biofilmes de 24 h. No entanto, os padrões de suscetibilidade dos biofilmes de 48 h e 72 h sugeriram que a capacidade de formar biofilmes e sua virulência podem depender do tempo de incubação de biofilmes, enfatizando a relevância da avaliação da heterosistência em biofilmes mais antigos.

Nosocomial infections by resistant bacteria are becoming a health threat causing around 25.000 deaths, per year. The mortality of these infections has been associated to the ability of bacteria in forming biofilms and developing resistance to antimicrobials, namely “heteroresistance”, where bacteria can be selected during antibiotic therapy, leading to treatment failure. It is, therefore, of crucial importance to understand this phenomenon developed by several bacteria. The goals of this work were: i) to assess and to compare the ability for biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae and Acinetobacter baumannii in single- and mixed-species populations; ii) to assess and to compare the response of planktonic cells and biofilms formed by those species to conventional antibiotics; iii) to inspect about the occurrence of heteroresistance in planktonic and biofilm populations. The biofilm-forming ability and viability of single and mixed populations were obtained by Cristal Violet (CV) assay and counting plate method expressed in colony forming units (CFU). Staphylococcus aureus displayed the highest number of viable cells and the greater biomass production. An antagonist relationship was observed for S. aureus and P. aeruginosa in mixed-species populations. A decrease in biomass production by P. aeruginosa was noted when co-cultured with K. pneumoniae and with A. baumannii, suggesting a mechanism of protection developed by these bacteria against P. aeruginosa. The susceptibility patterns of planktonic and biofilm cells were determined by the microdilution test. Planktonic cultures of P. aeruginosa, A. baumannii and K. pneumoniae showed a resistant behavior towards the antibiotic colistin, displaying a minimum inhibitory concentration (MIC) value 2-fold higher than the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) clinical breakpoints. Biofilms susceptibility patterns revealed a significant enhance of antimicrobial resistance compared to their planktonic counterparts. The occurrence of heteroresistance was investigated by population analysis profile (PAP). The heteroresistance phenomenon was found in planktonic cultures of K. pneumoniae and S. aureus, towards colistin and vancomycin, respectively. No previous studies had reported K. pneumoniae populations able to grow up to 16 mg/L of colistin. No heteroresistant subpopulations were detected in biofilm-related cells of 24 h-old biofilms. However, the susceptibility patterns of 48 h- and 72 h-old biofilms suggested that the ability to form biofilms and its virulence are dependent of the biofilms incubation time, emphasizing the relevance of evaluating heteroresistance in older/mature biofilms.