Electrochemical immunosensor for improved diabetic retinopathy diagnosis in minimally invasive biological fluids

Abstract

Diabetic retinopathy (DR) is one of the most common diabetes mellitus (DM) complications, that affects the retina and can lead to blindness. In 2017, it was estimated that approximately 150 million people suffered from this disease, and a rising tendency of around 30 % is expected until 2030. Available DR treatments are inefficient on halting disease progression in a significantly high percentage of people. Conventional DR diagnostics relies on qualitative, expensive and complex imaging methods. Technologies that enable an in situ quantitative analysis of DR’s impact do not exist, until this moment, in the market, thus revealing the potential and motivation for the present investigation. The use of minimally invasive biological fluids (like tears and saliva) for studying DR’s potential biomarkers is preferred to the highly invasive ocular fluids currently analyzed on clinical research. However, it is necessary to develop methods with high sensitivity and selectivity in minute sample volumes. The concentrations of IL-6 and MMP2, two biomarkers associated with DR, were assessed on the tears of controls and DR patients, using the Luminex protein quantification method, and statistically significant increased levels were found in case of disease. These results were provided by a close collaborative work with the University of Coimbra. Immunosensors for the detection of each biomarker were developed, in concentrations considered relevant for the diagnosis of DR in tears, primarily using standard solutions. Antibodies were used as specific biorecognition elements, and cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy were used for their detection and quantification. The presented biosensors further revealed to be the only technology adequate for all tear sampling methods, quantifying both biomarkers in DR critical concentrations, using only 1 μL of sample. As a complementary study, the IL-6 sensor was tested in saliva samples, and its analytical profile was compared with the Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) protein quantification method. The biosensor achieved similar results in ELISA-detectable concentrations, and an ability to quantify concentrations lower than this method’s limit of detection. Therefore, this work presents a novel technology, that may be integrated in point-of-care analytical devices for an in situ diagnosing and monitoring of DR, thus building a foundation for future work, with great potential for technology transfer.

A retinopatia diabética (RD) é uma das complicações mais comuns da diabetes, que afeta a retina e pode levar à cegueira. Em 2017, estimou-se que cerca de 150 milhões de pessoas sofriam desta doença, sendo expectável um crescimento na ordem dos 30 % até 2030. Os tratamentos existentes para a RD são ineficazes a travar a sua progressão numa percentagem significativa de pessoas. O diagnóstico convencional da RD depende de métodos de imagiologia qualitativos, dispendiosos e complexos. Tecnologias que permitam uma análise in situ quantitativa do impacto da RD são, até ao momento, inexistentes no mercado, revelando assim o potencial e a motivação para a presente investigação. O uso de fluidos biológicos minimamente invasivos (como lágrimas e saliva) para o estudo de potenciais biomarcadores da RD é preferível aos fluidos oculares altamente invasivos analisados atualmente em investigação clínica. No entanto, é necessário o desenvolvimento de métodos com alta sensibilidade e seletividade em volumes de amostra diminutos. As concentrações de IL-6 e MMP2, dois biomarcadores associados à RD, foram determinadas em lágrimas de controlos e pacientes com RD, utilizando o método de quantificação de proteínas Luminex, verificando-se um aumento estatisticamente significativo em caso de doença. Estes resultados provieram de uma colaboração estreita com a Universidade de Coimbra. Foram desenvolvidos imunossensores para a deteção de cada biomarcador, em concentrações relevantes para o diagnóstico da RD em lágrima, recorrendo primeiramente a soluções padrão. Foram utilizados anticorpos como elementos de bio-reconhecimento específico, e voltametria cíclica e espectroscopia de impedância eletroquímica para deteção e quantificação dos mesmos. Os biossensores apresentados revelaram ainda ser a única tecnologia adequada a todos os métodos de colheita de lágrimas, quantificando ambos os biomarcadores em concentrações críticas para a RD, usando apenas 1 μL de amostra. Como estudo complementar, o sensor IL-6 foi testado em amostras de saliva, e o seu perfil analítico comparado com o método de quantificação de proteínas Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). O biossensor apresentou resultados semelhantes em concentrações detetáveis por ELISA, e capacidade de quantificar concentrações inferiores ao limite de deteção deste método. Deste modo, este trabalho apresenta uma tecnologia inovadora, que poderá ser integrada em dispositivos analíticos point-of-care para o diagnóstico e monitorização da RD in situ, construindo assim uma base para trabalhos futuros, com elevado potencial para transferência de tecnologia.