Construction of genetic engineering tools for editing the genome of Ashbya gossypii

Abstract

Ashbya gossypii is a filamentous fungus with interesting properties for application in white biotechnology contexts and already employed for production of nearly 1000 tonnes of riboflavin per year. Many genetic elements and molecular tools of Saccharomyces cerevisiaehave conserved function in A. gossypiidue to the high genomic similarity observed inboth fungi (i.e. promoters, terminators, plasmids and selection markers). Ashbya gossypii is a filamentous fungus with interesting properties for application in white biotechnology contexts and already employed for production of nearly 1000 tonnes of riboflavin per year. Many genetic elements and molecular tools of Saccharomyces cerevisiae have conserved function in A. gossypii due to the high genomic similarity observed in both fungi (i.e. promoters, terminators, plasmids and selection markers). Moreover, if on one hand, strains expressing genes cloned in plasmids show high variability, on the other, homologous recombination is highly efficient for chromosomal gene integration. However, there is limited availability of characterized promoters, terminators and selection markers, and the molecular toolbox for pathway engineering still needs to be expanded. This limitation, on top of the multinucleated nature of the riboflavin overproducer and its lifecycle, makes the process time-consuming, requiring multiple rounds of cloning, transformation, and recycling of loxP-flanked selection markers. The widely used MEME algorithm allows the discovery of motifs in related protein or DNA sequences. This work made use of a publicly available gene expression data set to identify 4 overrepresented DNA motifs in intergenic sequences of highly expressed genes, 8 matching putative transcription factors, and TATA-box as important drivers of strong gene expression in A. gossypii. This bioinformatic approach can provide guidance for future rational design of synthetic and semi-synthetic promoters. Assembly methods such as In-Fusion®HD Cloning allow the construction of integration cassettes with multiple genes, cutting down the costs, the number of engineering rounds and of loxP scars in the genome of engineered strains. In this scope, the pUGprobe-AgI plasmid with promoter-containing variants developed in this work replicate in Escherichia coli and allow excision of the whole block by restriction digestion, generating two different fragments: the plasmid backbone and an expression cassette flanked by “homology arms” for chromosomal integration. The molecular toolbox developed will enable in short-term the systematic study of diverse promoters (synthetic and/or natural) and terminators, and in long-term will pave the way for multiplex pathway manipulation in the industrial cell factory A. gossypii.

Ashbya gossypii é um fungo filamentoso com propriedades interessantes para aplicação em biotecnologia industrial e já utilizado para produção de cerca de 1000 toneladas de riboflavina por ano. Vários elementos genéticos de Saccharomyces cerevisiae têm função conservada em ambos os fungos (p.e. promotores, terminadores, plasmídeos e marcas de seleção). Além disso, estirpes que expressam genes clonados em plasmídeos apresentam elevada variabilidade, mas por outro lado, a recombinação homóloga é altamente eficiente para integração cromossómica de genes. Contudo, existe uma disponibilidade limitada de promotores, terminadores e marcas de seleção caracterizados, e é necessário expandir o conjunto de ferramentas moleculares para engenharia de vias metabólicas. Esta limitação, somada à natureza multinucleada do fungo e do seu ciclo de vida, torna o processo moroso, requerendo múltiplas rondas de clonagem, transformação e reciclagem de marcas de seleção flanqueadas por sequências loxP. O algoritmo MEME, largamente utilizado, permite a descoberta de motivos em sequências de proteínas e DNA relacionadas entre si. Este trabalho utilizou dados publicamente disponíveis para identificar 4 motivos de DNA sobre representados em sequências intergénicas de genes altamente expressos, 8 putativos fatores de transcrição e a TATA-box como elementos importantes para uma expressão genética forte em A. gossypii. Esta abordagem bioinformática pode, futuramente, guiar o “design” racional de promotores sintéticos e semi-sintéticos. Métodos como o In-Fusion® HD Cloning permitem a construção de cassetes de integração com múltiplos genes, diminuindo os custos, o número de rondas de engenharia genética e de marcas loxP no genoma das estirpes modificadas. A sonda promotora desenvolvida neste trabalho, pUGprobe-AgI, e as suas variantes com promotor replica em Escherichia coli e permite a excisão de todo bloco com recurso a enzimas de restrição, gerando dois fragmentos: a cassete flanqueada por “braços de homologia” para integração cromossómica e o restante plasmídeo. O conjunto de ferramentas moleculares aqui desenvolvidos permitirá, a curto-prazo, o estudo sistemático de diversos promotores (sintéticos e/ou naturais) e terminadores, e a longo prazo, irão abrir caminho à manipulação “multiplex” de vias metabólicas na biofábrica industrial A. gossypii.