Strategies to increase 2-Phenylethanol production from L-Phenylalanine biotransformation using Yarrowia lipolytica as platform

Abstract

The biotechnological production of flavours and fragrances has become increasingly attractive due to its acceptability by the consumers since they are considered “natural” compounds. 2-Phenylethanol (2-PE) is an aromatic alcohol with delicate fragrance of rose petals, widely used in perfumes, cosmetics, foods, beverages, and pharmaceutical industries. The yeast Yarrowia can produce 2-PE through the L-Phenylalanine (L-Phe) biotransformation. However, it is poorly explored in this field, despite its interesting characteristics for this process, such as the Crabtree negative trait. Thus, the main goal of this work is to select different strains from the genus Yarrowia that are able to produce 2-PE and improve 2-PE productivity, combining strain selection and culture condition optimisation. Based on this, three strains of Yarrowia lipolytica (W29, CH 1/5 and CH 3/4) and one strain of Yarrowia divulgata (M 445/4) were selected. Firstly, it was studied the inhibitory effect of 2-PE and L-Phe on cell growth, and it was observed that all strains were inhibited by 2-PE concentrations above 2 g L-1, but only Y. lipolytica W29 was inhibited by 15 g L-1 L-Phe. Thereafter, the ability of the four strains to produce 2-PE was assessed at flask scale using glucose as carbon source. It was observed that all strains were able to produce 2-PE, from 1 to 2.2 g L-1. Afterwards, crude glycerol was used as an alternative carbon source for 2-PE production. All strains grew on this carbon source, however a 3-fold decrease in 2-PE concentration was observed, except for strain Y. lipolytica CH 1/5. Thus, Y. lipolytica CH 1/5 was selected for further studies, using crude glycerol as carbon source. The production of 2-PE by strain CH 1/5 was performed at bioreactor level, where a high cellular growth rate led to a faster uptake of L-Phe, and consequently to a low accumulation of 2-PE (0.76 g L-1). However, a step-wise fed-batch culture, with intermediate addition of L-Phe, allowed to increase the production of 2-PE attaining a final concentration of 3.2 g L-1. To our knowledge, this value corresponds to the highest titer of 2-PE obtained to date with Y. lipolytica.

A produção biotecnológica de aromas e fragrâncias tem-se tornado cada vez mais atrativa devido à sua aceitabilidade pelos consumidores, por serem considerados compostos “naturais”. O 2-Feniletanol (2-FE) é um álcool aromático com uma fragrância a pétalas de rosa, utilizado em perfumes, cosméticos, alimentos, bebidas e na indústria farmacêutica. A levedura Yarrowia pode produzir 2-FE por meio da biotransformação da L-Fenilalanina (L-Fe). No entanto, apesar de apresentar características interessantes para este processo, como ser Crabtree negativa, esta levedura é ainda pouco explorada para esta aplicação. Assim, o principal objetivo deste trabalho consiste em selecionar diferentes estirpes de Yarrowia que sejam capazes de produzir 2-FE e melhorar a sua produtividade, combinando a seleção de estirpes e a otimização das condições de cultivo. Para tal, foram rastreadas três estirpes de Yarrowia lipolytica (W29, CH 1/5 e CH 3/4) e uma de Yarrowia divulgata (M 445/4). Inicialmente, foi estudado o efeito inibitório do 2-FE e da L-Fe no crescimento celular, sendo observado que todas as estirpes foram inibidas por concentrações de 2-FE acima de 2 g L-1 e apenas o crescimento da estirpe Y. lipolytica W29 foi inibido para uma concentração de L-Fe de 15 g L-1. Posteriormente, a capacidade de produção de 2-FE pelas quatro estirpes foi avaliada em matraz, usando glucose como fonte de carbono. Foi observado que todas as estirpes produziam 2-FE, obtendo-se concentrações entre 1 e 2,2 g L-1. Depois, foi utilizado glicerol bruto como fonte de carbono alternativa, verificando-se que todas as estirpes conseguiram utilizar esta fonte de carbono, no entanto foi observado um decréscimo de 3 vezes na produção de 2-FE, exceto para Y. lipolytica CH 1/5. Assim, a estirpe Y. lipolytica CH 1/5 foi selecionada para estudos posteriores, assim como o glicerol bruto como fonte de carbono. A produção de 2-FE pela estirpe CH 1/5 também foi estudada em biorreator, onde foi possível observar um aumento significativo no crescimento celular, resultando num consumo mais rápido de L-Fe, e assim numa baixa concentração de 2-FE (0,76 g L-1). Em biorreator, o modo de operação descontínuo com alimentação por pulsos de L-Fe permitiu aumentar a produção de 2-FE, tendo-se obtido uma concentração final de 3,2 g L-1. De acordo com o nosso conhecimento, este valor corresponde à concentração de 2-FE mais alta obtida até ao momento com Y. lipolytica.