Development of PEGylated nanoparticles for delivery of methotrexate derivatives

Abstract

Cancer is one of the most devastating and life-threatening diseases, and conventional chemotherapeutic agents, such as methotrexate (MTX), present several limitations and adverse effects. The use of nanoparticles (NPs) enables an efficient alternative to conventional therapy as they can overcome these limitations. NPs may be engineered to have a prolonged circulation time, enhanced cellular uptake and targeting abilities. One widely used targeting approach is the development of NPs containing folic acid (FA) at the surface. Folate receptor (FR) is overexpressed in tumor cells and is not expressed or is present at low levels in normal cells. In this way, FA-tagged NPs allow a specific delivery of the drug. Although several types of NPs have been developed as drug delivery systems (DDS), this work focused on the polymeric micelles and liposomes. Thus, the main aim of this project was the development of PEGylated micelles and liposomes with suitable characteristics for intravenous (IV) administration and with the ability to delivery hydrophobic MTX derivatives to a target cell population. First of all, micelles and liposomes production methods were optimized. For the micelles production were tested two different methods, auxiliary solvent method and sonication, and the liposomes were produced using ethanol injection method. The full characterization of the developed NPs was performed, including the analysis of their physicochemical properties, stability, drug encapsulation efficiency (EE) and biological effect. The use of the auxiliary solvent method with evaporation at 30 ºC, a polyoxyethanyl-α-tocopheryl sebacate (PTS) concentration of 15 mg/mL and a PTS/MTX diethylated (MTX-OEt) mass ratio of 8:1 resulted in monodisperse micelles with small size. These PEGylated micelles revealed the expected biological effect against cancer cells (Caco-2 cells). In the case of liposomes, the ideal formulation was reached using a lipid concentration of 9 mM, water as aqueous phase, a MTXdimethyldioctadecylammonium bromide (MTX-DODAB) concentration of 2.91 mg/mL and an initial water/ethanol volume of 6/6 mL. The obtained liposomes also showed suitable characteristics including a monodisperse population of small and neutral particles and demonstrated a significant cytotoxicity against cancer cells, similar to free MTX. In sum, the developed PEGylated micelles and liposomes loaded with hydrophobic MTX derivatives demonstrated to be promising DDS for cancer therapy.

O cancro é uma das doenças mais devastadoras e fatais, e os agentes quimioterápicos convencionais, como o metotrexato (MTX), apresentam várias limitações e efeitos adversos. O uso de nanopartículas (NPs) possibilita uma alternativa eficiente à terapia convencional, pois estas podem superar essas limitações. As NPs podem ser projetadas para ter um tempo de circulação prolongado, melhor captação celular e habilidades de direcionamento. Uma abordagem de direcionamento amplamente utilizada é o desenvolvimento de NPs contendo ácido fólico (FA, do inglês folic acid) à superfície. O recetor de folato (FR, do inglês folate receptor) é sobre-expresso em células tumorais e não é expresso ou está presente em níveis baixos em células normais. Deste modo, as NPs com FA permitem uma entrega específica do fármaco. Embora vários tipos de NPs tenham sido desenvolvidos como sistemas de entrega de fármacos (DDS, do inglês drug delivery systems), este trabalho focou-se nas micelas poliméricas e nos lipossomas. Assim, o principal objetivo deste projeto foi o desenvolvimento de micelas e lipossomas PEGuilados com características adequadas para administração intravenosa (IV) e com a capacidade de entregar derivados hidrofóbicos de MTX a uma população de células alvo. Primeiramente, os métodos de produção de micelas e lipossomas foram otimizados. Para a produção de micelas foram testados dois métodos diferentes, o método do solvente auxiliar e sonicação, e os lipossomas foram produzidos pelo método de injeção etanólica. A caracterização completa das NPs desenvolvidas foi realizada, incluindo a análise das suas propriedades físico-químicas, estabilidade, eficiência de encapsulação do fármaco (EE) e efeito biológico. O uso do método do solvente auxiliar com evaporação a 30 ºC, uma concentração de sebacato de polioxietanil-α-tocoferil (PTS) de 15 mg/mL e uma relação mássica de PTS/MTX dietilado (MTX-OEt) de 8:1 originou micelas monodispersas e com tamanho pequeno. Estas micelas PEGuiladas revelaram o efeito biológico esperado contra células de cancro (células Caco-2). No caso dos lipossomas, a formulação ideal foi alcançada utilizando uma concentração lipídica de 9 mM, água como fase aquosa, uma concentração de MTX-brometo de dimetildioctadecilamónio (MTX-DODAB) de 2.91 mg/mL e um volume inicial de água/etanol de 6/6 mL. Os lipossomas obtidos também apresentaram características adequadas, incluindo uma população monodispersa de partículas pequenas e neutras que demonstraram uma citotoxicidade significativa contra células de cancro, semelhante ao MTX livre. Em suma, as micelas e os lipossomas PEGuilados desenvolvidos, carregados com derivados hidrofóbicos de MTX, demostraram ser DDS promissores para a terapia do cancro.