Validation of a bacteriophage platform for early detection of Alzheimer’s disease

Abstract

Alzheimer’s disease is a chronic, progressive and degenerative brain disease that affects millions of people worldwide. Several studies suggest that amyloid-beta peptide accumulation and aggregation could be the responsible for the mental decline in patients. Currently, only a late diagnosis is possible, since this disease is only detected when there is already neuron damage, so it is crucial to develop new techniques for early detection to control or treat the disease, even before the first symptom’s appearance. Treatment is even more complicated since there are not any efficient pharmacologic treatments available to slow down or halt neurons damage. The development of new effective therapeutics is not easy due to the existence of the blood brain barrier that shelters the central nervous system from the systemic circulation however, this bottleneck can be overcome by the use of viruses. Bacteriophages (phages) are viruses which infect only bacterial cells being the filamentous phages (as M13), able to display on their surface peptide sequences by Phage Display technology. New phage particles displaying peptides able to recognize and bind with high affinity to amyloid-beta species, can form a stable complex phage-target which can be cleared by the immune system (for therapeutics). Furthermore, it was proved that the M13 phage can cross the blood brain barrier, which allow the brain target recognition (for diagnosis) and the amyloid-beta fibrils disaggregation and clearance (for therapeutics). The main goal of this thesis was to validate a previously developed amyloid-beta specific bacteriophage-based platform. Two amyloid-beta-specific phages were previously engineered, the AB2 and the AB3 phages, to express on their surface peptide sequences capable of bind to oligomers and fibrils of amyloid-beta. The new engineered phages ability to recognize and bind to these species and their efficiency to cross the blood brain barrier, were assessed in this work. Immunofluorescence assays proved the affinity of the new phages towards amyloid-beta species in mice and human brain tissue with Alzheimer´s. In vitro studies with a blood brain barrier model proved that these new phages successfully crossed the barrier. However, this model does not mimic the in vivo conditions, so it was important to evaluate the phages behaviour in vivo. The in vivo assays showed the biodistribution and kinetic profiles of the M13 phage and the new phages ability to cross the blood brain barrier and being detected in the mice brain. In conclusion, all objectives were accomplished, leaving the opportunity for a promising further work.

A Doença de Alzheimer é uma doença crónica, progressiva e neurodegenerativa que afeta milhões de pessoas no mundo. Pensa-se que a acumulação progressiva de péptidos de amiloide-beta no cérebro possa ser a responsável pelo declínio mental dos pacientes. Atualmente é apenas possível um diagnóstico tardio desta doença visto ser detetada quando já existem danos neuronais. Assim, é essencial desenvolver novas técnicas para um diagnóstico precoce de modo a controlar e tratar a doença mesmo antes do aparecimento dos primeiros sintomas. O tratamento desta doença é ainda mais complicado visto não existir qualquer tratamento farmacológico capaz de abrandar ou impedir o dano neuronal. Além disso, a existência da barreira hematoencefálica dificulta o desenvolvimento de fármacos, contudo este desafio pode ser ultrapassado com recurso aos vírus. Os bacteriófagos (fagos) são vírus que afetam apenas bactérias, sendo os fagos filamentosos (como o M13) capazes de expressar à sua superfície sequências peptídicas através da técnica de Phage Display. Estes fagos, ao expressarem péptidos capazes de reconhecerem e se ligarem com afinidade a diferentes espécies de amiloide-beta, podem originar um complexo estável passível de ser eliminado pelo sistema imunitário. O fago M13 é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica, o que permite ainda um reconhecimento no tecido cerebral. Assim, o principal objetivo desta dissertação foi validar uma plataforma baseada em bacteriófagos específica para amiloide-beta. Previamente, o fago M13 foi manipulado geneticamente de forma a construir os fagos AB2 e AB3, expressando cada um na sua superfície uma sequência peptídica capaz de reconhecer oligómeros e fibras de amiloide-beta. A capacidade destes novos fagos de reconhecer amiloide-beta e de atravessar a barreira hematoencefálica foi validada neste trabalho. Ensaios de imunofluorescência demonstraram que os novos fagos são capazes de se ligar especificamente às espécies de amiloide-beta presentes em tecido cerebral de ratinho e de humano manifestando a doença. Os estudos in vitro, usando um modelo de barreira hematoencefálica, provaram que estes fagos atravessam com sucesso a barreira. Contudo, este modelo de barreira in vitro não reproduz todas as condições in vivo, daí ter sido avaliado o comportamento dos fagos in vivo. Ensaios in vivo, usando um modelo de ratinho com doença de Alzheimer, demostraram a biodistribuição e a cinética do fago M13 e a capacidade dos novos fagos atravessarem a barreira hematoencefálica e serem detetados no cérebro de ratinho. Para concluir, todos os objetivos foram cumpridos deixando a oportunidade para um promissor trabalho futuro.