Construction of engineered microorganisms for application in microbial enhanced oil recovery

Abstract

Microbial enhanced oil recovery (MEOR) is a tertiary oil recovery technique that uses microorganisms and their metabolites to recover the oil entrapped in the reservoirs. One of the main drawbacks related with the application of in situ MEOR is the shortage of microorganisms capable of growing and producing the desired bioproducts at the harsh conditions of the oil reservoir. Thus, the aim of this Thesis was the design and construction of microorganisms with the ability of producing biopolymers at high temperatures and oxygen-limiting conditions through protoplasts fusion. For this purpose, a biopolymer-producing strain (Rhizobium viscosum CECT 908) and a Bacillus subtilis strain isolated from an oil reservoir were used as parental strains. Several parameters were optimized to increase the protoplasts formation and regeneration frequencies for each parental strain. The most favourable conditions for protoplasts formation were an incubation with EDTA (2.9 g/L) for 60 min at 30°C followed by a treatment with 2 g/L of lysozyme for 1 h at 37°C for R. viscosum CECT 908, and incubation with 3 g/L of lysozyme for 1 h at 37°C without EDTA treatment for B. subtilis PX573. Other parameters were also evaluated to improve the protoplasts regeneration and fusion, including the use of different osmotic stabilizers and regeneration media, and the incubation time with the fusogenic agent. However, after protoplasts fusion, it was not possible to obtain recombinant strains combining the desired properties of the parental strains. In addition, four Paenibacillus sp. strains were identified as new and promising biopolymer producers. These isolates produced up to 30 g/L of biopolymer in the optimized culture medium, achieving apparent viscosity values as high as 54000 mPa s (80 times higher when compared with R. viscosum CECT 908). In oil recovery assays performed in sand-pack columns using a heavy crude oil (η40 ºC≈545 mPa s), these biopolymers allowed a recovery of 41.9 ± 0.7% of the entrapped oil, thus being promising candidates for application in MEOR. The effect of the combination of biosurfactants and biopolymers in oil recovery was also studied using the same crude oil. The results obtained demonstrated that the combination of biopolymer (R. viscosum) and surfactin (B. subtilis) resulted in similar oil recoveries (47.2 ± 0.7%) when compared with the biopolymer alone (46.2 ± 3.8%), whereas surfactin alone was unable of recovering this type of oils.

A recuperação avançada de petróleo com microrganismos (MEOR) é uma técnica de recuperação terciária que usa microrganismos e os seus metabolitos para recuperar o óleo que ficou preso nos reservatórios. Uma das principais desvantagens na aplicação de processos de MEOR in situ é a escassez de microrganismos capazes de crescer e produzir os bioprodutos desejados nas condições adversas do reservatório petrolífero. Assim, o objetivo desta tese foi a construção de microrganismos capazes de produzir biopolímeros quando expostos a altas temperaturas e em condições limitantes de oxigénio através de fusão de protoplastos. Nesse sentido, uma estirpe produtora de biopolímero (Rhizobium viscosum CECT 908) e a estirpe Bacillus subtilis, isolada a partir de um reservatório petrolífero, foram usadas como estirpes parentais. Diversos parâmetros foram otimizados de modo a aumentar as frequências de formação e regeneração de protoplastos para cada estirpe parental. As condições mais favoráveis para a formação de protoplastos foram uma incubação com EDTA (2.9 g/L) durante 60 min a 30°C seguida de um tratamento com 2 g/L de lisozima durante 1 h a 37°C para R. viscosum CECT 908, e a incubação com 3 g/L de lisozima durante 1 h a 37°C sem tratamento com EDTA para B. subtilis PX573. Outros parâmetros foram também avaliados para melhorar a regeneração e fusão de protoplastos, incluindo o uso de diferentes estabilizadores osmóticos e meios de regeneração, e o tempo de incubação com o agente fusogénico. Contudo, após a fusão de protoplastos, não foi possível obter estirpes recombinantes contendo as propriedades desejadas das estirpes parentais. Adicionalmente, quatro estirpes de Paenibacillus sp. foram identificadas como novas e promissoras produtoras de biopolímeros. Estes isolados produziram até 30 g/L de biopolímero no meio de cultura otimizado, atingindo valores de viscosidade aparente de 54000 mPa s (80 vezes maiores quando comparado com o biopolímero de R. viscosum CECT 908). Nos ensaios de recuperação de óleo em colunas de areia usando um óleo de elevada viscosidade (η40ºC≈545 mPa s), estes biopolímeros permitiram a recuperação de 41.9 ± 0.7% do óleo retido, sendo candidatos promissores para a aplicação em MEOR. O efeito da combinação de biosurfactante e biopolímero na recuperação de óleo foi também estudado usando o mesmo óleo. Os resultados obtidos demonstraram que a combinação de biopolímero (R. viscosum) e surfactina (B. subtilis) levou a recuperações de óleo semelhantes (47.2 ± 0.7%) quando comparada com o biopolímero isolado (46.2 ± 3.8%), enquanto que a surfactina isolada foi incapaz de recuperar este tipo de óleo.