The effects of anti-leukemia chemotherapy on LKB1-AMPK pathway functioning in acute myeloid leukemia cell lines

Abstract

Acute myeloid leukemia (AML) is a clonal disorder characterized by genetic alterations in hematopoietic stem and/or progenitor cells, leading to the accumulation of leukemic myeloblasts. Current AML therapies rely mainly on high doses of cytarabine and doxorubicin, which promote good outcomes for young patients but that are highly toxic and have limited application and poor outcomes among old individuals. Thus, the elucidation of the mechanisms underlying AML cell’s response to conventional chemotherapy is still a major challenge. Studies showed that some anticancer agents that induce DNA damage activate a DNA damage response (DDR), involving the phosphorylation of proteins such as AMP-activated protein kinase (AMPK), that leads to autophagy induction as a pro-survival mechanism. Cytarabine and doxorubicin are inducers of DNA damage and DDR, however, the study of their effects in AML cells is still very scarce. Our preliminary data showed that AML cells treated with conventional chemotherapy displayed cell cycle arrest in G0/G1 and S phases associated with autophagy induction. Therefore, this work aimed to understand if the activation of AMPK pathway with consequent cell cycle arrest and autophagy induction could act as a pro-survival mechanism in AML cells. For such purpose, two AML cell lines (HL-60 and KG-1) were used as in vitro models and their response to conventional chemotherapy, cytarabine and/or doxorubicin was evaluated. The effect of conventional chemotherapy combination with rapamycin or chloroquine (CQ), autophagy activator or inhibitor, respectively, was also determined. Results suggested that cytarabine or doxorubicin promote DNA damage in HL-60 cells, which leads to the activation of AMPK pathway culminating in G0/G1 cell cycle arrest and autophagy induction as a pro-survival mechanism. Whether anti-leukemia agents promote DNA damage in KG-1 cells is inconclusive due to the high endogenous levels of DNA damage displayed by these cells, however, our data showed that doxorubicin alone or combined with cytarabine promote AMPK pathway activation, S phase cell cycle arrest and autophagy induction as a tumor suppressor mechanism. Results obtained with the combination of anti-leukemia agents with CQ showed a decrease in HL-60 cell viability but an increase in KG-1 cell viability, supporting the hypothesis that this process may function as a pro-survival in HL-60 cells but a pro-death in KG-1 cells. Therefore, different approaches involving the combination of conventional chemotherapy with AMPK/autophagy modulators could be a good strategy for combined chemotherapy in AML.

A leucemia mielóide aguda (LMA) é uma doença clonal caracterizada por alterações genéticas nas células estaminais e/ou progenitoras hematopoiéticas, resultando numa acumulação de mieloblastos leucémicos. A actual terapia anti-leucémica consiste principalmente na aplicação de elevadas doses de citarabina e doxorubicina. Apesar deste regime terapêutico ser eficiente em pacientes jovens, a sua aplicação é limitada e tem resultados insatisfatórios em pacientes idosos. Desta forma, a elucidação dos mecanismos celulares de resposta das células de LMA à quimioterapia convencional é ainda um grande desafio. Diferentes estudos demonstraram que alguns agentes anticancerígenos indutores de danos no DNA activam uma resposta celular a estes danos, que envolve a fosforilação de proteínas tais como “AMP-activated protein kinase” (AMPK), resultando numa indução de autofagia como mecanismo de adaptação e sobrevivência. A citarabina e a doxorubicina são conhecidos indutores de danos no DNA e da resposta celular a estes danos, no entanto, os dados sobre estes efeitos em células de LMA são ainda muito escassos. Dados preliminares do nosso grupo demonstraram que células de LMA tratadas com quimioterapia convencional exibem uma paragem do ciclo celular nas fases G0/G1 e S associada com a indução de autofagia. Assim, este trabalho pretende determinar se a activação da via AMPK com consequente paragem do ciclo celular e indução de autofagia pode constituir um mecanismo de adaptação e sobrevivência das células de LMA. Para isso, duas linhas celulares de LMA (HL-60 e KG-1) foram usadas como modelos in vitro, sendo sujeitas a tratamento com citarabina e/ou doxorubicina. O efeito da combinação da quimioterapia convencional com rapamicina ou cloroquina (CQ), um activador ou inibidor da autofagia, respectivamente, foi também avaliado. Os resultados obtidos indicaram que a citarabina e a doxorubicina promovem danos no DNA nas células HL-60, os quais levam à activação da via do AMPK culminando numa paragem do ciclo celular nas fases G0/G1 e indução de autofagia como mecanismo de sobrevivência. Apesar de os resultados serem inconclusivos no que diz respeito à indução de danos no DNA nas células KG-1, principalmente devido aos elevados níveis endógenos de danos no DNA apresentados por estas células, os nossos resultados indicam que a doxorubicina sozinha ou combinada com a citarabina promove activação da via AMPK, paragem no ciclo celular na fase S e indução de autofagia como mecanismo associado à morte celular. Os resultados obtidos com a combinação da terapia convencional com a CQ mostraram uma diminuição da viabilidade das células HL-60 mas um aumento da viabilidade das células KG-1, suportando a hipótese de que a autofagia funciona como um mecanismo de sobrevivência nas células HL-60 mas como um mecanismo associado à morte nas células KG-1. Assim, diferentes metodologias envolvendo a combinação da quimioterapia convencional com moduladores do AMPK/autofagia poderão ser uma boa estratégia terapêutica para pacientes com LMA.