Development of a phage-based lab-on-chip for the detection of foodborne pathogens

Abstract

Foodborne diseases are caused by the ingestion of contaminated food or water, representing a worldwide problem. Campylobacter and Staphylococcus are important pathogens to control, since they are frequent causes of foodborne illness and represent a challenge for the food industry. The microbiological techniques remain the gold standard for detection of pathogens but are time consuming and extremely laborious. Other methods such as the PCR (Polymerase chain reaction) and the ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) offer more advantages however still require appropriate instrumentation and cannot be used on-site. The biosensors are pointed out as good candidates to overcome these limitations since they have high degree of sensitivity, cost-effectiveness, and portability. Magnetoresistive (MR) sensors associated with magnetic particles as reporter systems on lab-on-chip platforms have promising characteristics namely response speed, high sensitivity, and simple operation. The biorecognition elements are the key to the recognition specificity of biosensor technologies. Bacteriophages (or phages) are viruses that infect bacteria and are highly specific. Phage proteins such as the receptor binding proteins (RBPs) and the cell wall binding domains (CBDs) of phage endolysins are responsible for the phage host recognition and thus are promising molecules to be used on bacterial detection. The main goal of this project was to develop a tool based on a MR lab-on-chip platform for detection of Campylobacter and Staphylococcus, using a RBP and a CBD as recognition elements, respectively. In order to achieve this goal, the genes encoding a CBD from a Staphylococcus aureus phage endolysin and a RBP from a Campylobacter coli phage were cloned, and the proteins expressed and purified. The CBD showed binding specificity against the genus Staphylococcus, while the RBP presented high binding specificity for C. coli and Campylobacter jejuni strains. Both proteins showed binding affinity towards the target bacteria when immobilized on gold substrates which mimics the sensors surface. Also both proteins were efficiently used for the functionalization of MNPs, allowing a specific bacterial concentration from suspensions. The MR- biochip platform assays, in which different approaches were used to detect C. coli and S. aureus, revealed a detectable signal for both bacteria, suggesting that the developed phage-based labon- chip tool holds potential to be used for the rapid and sensitive detection of pathogens.

As doenças de origem alimentar são causadas pela ingestão de água e alimentos contaminados, representando um problema à escala mundial. Campylobacter e Staphylococcus são importantes patogénios uma vez que são causas frequentes de doenças e um desafio para a indústria alimentar. As técnicas microbiológicas continuam a ser o padrão na deteção de agentes patogénicos, mas são demoradas e extremamente trabalhosas. Outros métodos tais como o PCR (Polymerase chain reaction) e o ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) oferecem mais vantagens, contudo, ainda requerem instrumentação adequada e não podem ser utilizados no local. Os biossensores são apontados como candidatos para superar estas limitações uma vez que têm elevado grau de sensibilidade, relação custo-eficácia e portabilidade. Os sensores magnetoresistivos associados à utilização de partículas magnéticas como sistema repórter apresentam características promissoras, inclusive, velocidade de resposta, elevada sensibilidade e manuseamento simples. Os elementos de bioreconhecimento são a chave para a especificidade em biossensores. Os bacteriófagos (fagos) são vírus que infetam bactérias e são muito específicos. As “Receptor binding proteins” (RBPs) e “cell wall binding domains” (CBDs) de endolisinas de fagos são responsáveis pelo reconhecimento das células hospedeiras e, portanto, são moléculas promissoras para utilizar na deteção de bactérias. O principal objetivo deste projeto foi desenvolver uma ferramenta baseada numa plataforma labon- chip para a deteção de Campylobacter e Staphylococcus, usando uma RBP e uma CBD como elementos de reconhecimento, respetivamente. De forma a atingir este objetivo, os genes que codificam uma CBD de uma endolisina do fago de Staphylococcus aureus e uma RBP do fago de Campylobacter coli foram clonados, e as proteínas expressas e purificadas. A CBD mostrou especificidade de ligação contra bactérias do género Staphylococcus, enquanto a RBP apresentou elevada especificidade para C. coli e Campylobacter jejuni. Ambas as proteínas mostraram afinidade de ligação contra as bactérias alvo quando imobilizados em substratos de ouro, que mimetiza a superfície dos sensores. Além disso, ambas as proteínas foram utilizadas eficazmente para a funcionalização de nanopartículas permitindo concentrar a bactéria a partir de suspensões. Os ensaios da plataforma lab-on-chip, nos quais diferentes abordagens foram usadas para detetar C. coli e S. aureus, revelaram um sinal detetável para ambas as bactérias, o que sugere que esta plataforma tem potencial para ser aplicada na deteção rápida e sensível de agentes patogénicos.