Preparation of a standardized methodology for the growth of Pseudomonas aeruginosa biofilms and evaluation of their response to antimicrobial peptide strategies

Abstract

Novel antimicrobial products, such as antimicrobial peptides (AMPs), are being investigated to combat clinically relevant biofilms and their growing antimicrobial resistance. These relevant studies, however, lack protocol standardization. Acknowledging the importance of standardized methodologies to ensure the quality of experimental results, this dissertation initiates the establishment of a standardized operational procedure (SOP) for the growth of P. aeruginosa biofilms. The proposed SOP was evaluated statistically, firstly in terms of repeatability and ruggedness. The method showed a repeatability greatly influenced by between experimental variance. The variability of the live organism at study or other uncontrollable or yet unknown variable could be the cause. The ruggedness of the protocol showed that slight variations to some of the SOP conditions cause differences in the results, meaning that these variables are important in the biofilm growth and must be tightly controlled. Furthermore, this thesis evaluated the P. aeruginosa biofilms’ response to prophylactic and therapeutic control approaches using the AMPs colistin, tachyplesin III and lactoferricin B, alone or combined. The analysis conjugates information from biomass, respiratory activity and cell viability measurements. Results show that the prophylactic approach revealed that combinations of colistin and tachyplesin III with lactoferricin B are capable of inhibiting biofilm formation at low concentrations. In the preliminary therapeutic tests, although the results were not as good, the colistin and lactoferricin B combination was able to eradicate most of the biofilm for the strain P. aeruginosa ATCC 10145.

Novos compostos antimicrobianos, tais como os péptidos antimicrobianos (AMPs), estão a ser investigados para combater biofilmes de relevância clínica e a sua crescente resistência a antimicrobianos tradicionais; no entanto, estes estudos carecem de protocolos padronizados. Reconhecendo a sua importância para garantir a qualidade dos resultados experimentais, esta dissertação inicia o estabelecimento de um procedimento operacional padronizado (SOP) para o crescimento de biofilmes de P. aeruginosa. O SOP proposto foi avaliado estatisticamente em termos de repetibilidade e robustez. O método mostrou uma repetibilidade muito influenciada pela variância entre experiências. A variabilidade do organismo vivo estudado ou outra variável incontrolável ou desconhecida pode ser a causa. Por sua vez, a robustez do protocolo mostrou que pequenas variações em algumas condições do SOP causam diferentes resultados, o que significa que estas variáveis são importantes no crescimento do biofilme e devem ser bem controladas. Esta dissertação também avaliou a resposta dos biofilmes de P. aeruginosa a abordagens profiláticas e terapêuticas usando os AMPs colistina, taquiplesina III e lactoferricina B, isolada ou combinadamente. A análise conjugou informação da biomassa, da atividade respiratória e da viabilidade celular. Os resultados mostram que na abordagem profilática, as combinações de colistina e taquiplesina III com lactoferricina B são capazes de inibir a formação de biofilme em concentrações baixas. Nos ensaios preliminares terapêuticos, ainda que os resultados não sejam tão bons, a combinação de colistina e lactoferricina B foi capaz de erradicar a maior parte do biofilme para a estirpe P. aeruginosa ATCC 10145.