Virulence of Salmonella enterica Enteritidis biofilms after exposure to different disinfectants

Abstract

Microbial contamination is an ongoing concern in food processing areas, mainly due to its impact in global public health. In recent years, most of the reported foodborne outbreaks have been caused by Salmonella Enteritidis. Although there are several disinfectants used in food environments, it has been reported that microbial cells that survive chemical disinfection may express resistance to antibiotics and changes in gene expression. However, there is still a lack of knowledge about these phenomena regarding biofilms cells, which is a matter of concern due to the increased disinfection resistance associated with these microbial communities. Hence, the main goal of this study was to investigate the effect of exposure to chemical disinfectants in the resistance and virulence of S. Enteritidis biofilm cells, in order to have some insights about what may occur in case cells released from these biofilms come in contact with a host. To this purpose, in first stage, biofilms susceptibility was evaluated to four disinfectants commonly used in food industry – benzalkonium chloride, triclosan, sodium hypochlorite and peroxide hydrogen –, and then biofilms were periodically exposed to sublethal concentrations of each disinfection agent, in order to get an approach to what may happen in food processing facilities when insufficient cleaning and disinfection take place. After exposure to the disinfectants, biofilm-derived cells were phenotypically characterized in terms of biofilm formation ability and resistance to antibiotics, including four of the most commonly used to treat salmonellosis (ampicillin, ciprofloxacin, cefotaxime and chloramphenicol) and one with a wide range of activity (tetracycline). Moreover, analysis of stress response gene rpoS and virulence genes invA, avrA and csgD was also performed through quantitative real-time polymerase chain reaction. The results showed that S. Enteritidis biofilm-derived cells were more susceptible to triclosan and less susceptible to sodium hypochlorite and peroxide hydrogen. Regarding antibiotic susceptibility, biofilm-derived cells demonstrated a lower susceptibility than planktonic cells. Moreover, despite exposure to disinfectants led to alterations on antibiotic susceptibility, no resistance was observed. The only exception corresponded to ciprofloxacin, to which both planktonic and biofilm cells, before and after exposure, were considered resistant. Exposure to sodium hypochlorite and peroxide hydrogen enhanced biofilm formation ability and, concerning gene expression, benzalkonium chloride was the disinfectant with the highest influence on the overexpression of S. Enteritidis virulence genes. In view of the results obtained in this study, biofilm cells that survived to disinfecting agents may represent an increased public health risk, since they can present decreased susceptibility to antibiotics, enhanced biofilm formation ability, and an overexpression of virulence and stress response genes, which may lead to an increase in Salmonella pathogenicity in the case of a possible infection occur by contact of these biofilm-derived cells with a host.

A contaminação microbiana constitui um grave problema em áreas de processamento alimentar, principalmente devido ao impacto que apresenta na saúde pública global. Nos últimos anos, a maioria dos surtos alimentares tem vindo a ser causado por Salmonella Enteritidis. Embora existam vários desinfetantes disponíveis, tem vindo a ser reportado que células microbianas capazes de sobreviver à desinfeção química podem expressar resistência a antibióticos e mudanças na sua expressão genética. Contudo, há ainda uma falha de conhecimento no que se refere a células de biofilme, os quais representam uma preocupação acrescida no âmbito alimentar dada a sua maior resistência à desinfeção. Assim, o principal objetivo deste estudo foi investigar o efeito da exposição a desinfetantes na virulência de células de biofilmes de S. Enteritidis, de modo a obter algumas indicações sobre o que poderá acontecer no caso de células libertadas por estes biofilmes entratarem em contacto com um hospedeiro. Numa primeira etapa, foi avaliada a suscetibilidade dos biofilmes a quatro desinfetantes comummente utilizados na indústria alimentar – cloreto de benzalcónio, triclosan, hipoclorito de sódio e peróxido de hidrogénio -, seguindo-se a exposição periódica dos biofilmes a concentrações subletais de cada um dos desinfetantes, de modo a mimetizar o que acontece em instalações de processamento alimentar quando ocorre limpeza e desinfeção insuficientes. Após exposição aos desinfetantes, as células provenientes de biofilme foram caracterizadas fenotipicamente em termos de capacidade de formação de biofilme e de resistência a quatro dos antibióticos mais comumente usados para tratar salmonelose (ampicilina, ciprofloxacina, cefotaxima e cloranfenicol), assim como a um antibiótico com vasta gama de atividade (tetraciclina). Além disso, também foi realizada a análise de expressão do gene de resposta ao stress ropS e dos genes de virulência invA, avrA, csgD, através da reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa. Os resultados obtidos demonstraram que células derivadas de biofilme foram mais suscetíveis ao triclosan e menos suscetíveis ao hipoclorito de sódio e ao peróxido de hidrogénio. Relativamente à suscetibilidade a antibióticos, as células provenientes de biofilme revelaram uma menor suscetibilidade do que as células planctónicas. Apesar de a exposição ter levado a alterações da suscetibilidade a antibióticos, não foi observada a ocorrência de resistência. A única exceção correspondeu à ciprofloxacina, para a qual células planctónicas e de biofilme, antes e após exposição, foram consideradas resistentes. O hipoclorito de sódio e o peróxido de hidrogénio provocaram um aumento da capacidade de formação de biofilme e o cloreto de benzalcónio foi o desinfetante com uma maior influência na sobre-expressão de genes de virulência. Face aos resultados obtidos é possível concluir que células de biofilme sobreviventes a agentes de desinfeção podem representar um risco acrescido para a saúde pública, uma vez que podem apresentar uma diminuição da suscetibilidade a antibióticos, maior capacidade de formação de biofilme e uma sobre-expressão de genes de virulência, que por sua vez podem levar a um aumento da patogenicidade de Salmonella no caso de uma possível infeção ocorrer pelo contacto destas células provenientes de biofilme com um hospedeiro.