Polymicrobial interactions in infections: the case Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans in ventilator-associated pneumonia

Abstract

Ventilator-associated pneumonia (VAP) is one of the most common nosocomial pneumonia among intensive care units contributing to high rates of morbidity and mortality. Polymicrobial biofilm infections with Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans have being recently reported in VAP. Their antimicrobial resistance profiles represent a serious impact on the treatment of the disease by reducing the effective therapies and affecting the state of health of patients. As such, the present work aimed to provide novel insights concerning the characterization of single- and dual-species biofilms phenotype involving P. aeruginosa and C. albicans under the presence of different antimicrobials agents. Planktonic and biofilm assays were performed using P. aeruginosa PAO1, C. albicans SC5314 and four clinically important antimicrobials: amphotericin B (AmB), tobramycin (ToB), colistin (CoL) and polymyxin B (PolyB) as single or in combination. The quantitative methods (CFUs enumeration and biomass quantification) and qualitative methods (SEM, PNA FISH analysis and LIVE/DEAD staining) were used to study the single- and dual-species biofilms. The results showed that the incubation time did not influence biofilm formed by both pathogens in the overall consortia. Concerning single antimicrobials use, P. aeruginosa was the pathogen more sensitive to most tested antimicrobials and their effect showed to be concentration and time dependent. For antimicrobial combinations it was demonstrated that most formulations presented synergistic effect in P. aeruginosa, both in single and in mixed planktonic cultures. Specially, when applied to biofilms only AmB/PolyB and ToB/PolyB combinations (particularly with PolyB at high concentrations: 256 mg/L), promoted a significant reduction in the number of cultivable cells of both strains entrapped in single- and in dual-species biofilms. However, PNA FISH analysis and LIVE/DEAD staining showed that both strains are still existent and viable in presence of these antimicrobial combinations. In conclusion, different antimicrobial therapies used in this work did not display any effectiveness in the treatment of polymicrobial infections associated to VAP. Nevertheless, certain antimicrobial combinations tested in this work are essentials to future studies in order to better clarify the clinical dosage concentrations. Despite of the aforementioned concentrations being toxicity for humans they present strong potency to be used in future novel methodologies for VAP therapy.

A pneumonia associada a ventilação (PAV) é uma das pneumonias nosocomiais mais comuns nas unidades de cuidados intensivos contribuindo para elevadas taxas de morbidade e mortalidade. As infeções polimicrobianas associadas a biofilmes causadas por Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans têm sido recentemente relatadas na PAV. Os seus perfis de resistência antimicrobiana representam um sério impacto no tratamento da doença, devido à diminuição da eficácia das terapias afetando assim o estado de saúde dos pacientes. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo aumentar o conhecimento relativo à caracterização fenotípica de biofilmes simples e duplos envolvendo P. aeruginosa e C. albicans na presença de diferentes agentes antimicrobianos. Para tal, foram realizados ensaios planctônicos e de biofilmes utilizando P. aeruginosa PAO1, C. albicans SC5314 e quatro agentes antimicrobianos de relevância clínica: anfotericina B (AmB), tobramicina (ToB), colistina (COL) e polimixina B (PolyB), com utilização única ou em combinação. Os métodos quantitativos (enumeração de unidades formadoras de colónias e quantificação de biomassa) e métodos qualitativos (visualização em microscópio eletrónico de varrimento, análise PNAFISH e coloração LIVE/ DEAD) foram realizados com o objetivo de estudar os biofilmes simples e duplos. Os resultados mostraram que o tempo de incubação não influenciou a formação de biofilme por parte de ambos os agentes patogénicos no consórcio global. Relativamente ao uso de um único agente antimicrobiano, a bactéria P. aeruginosa foi o agente patogénico mais sensível aos antimicrobianos testados revelando um efeito dependente da concentração e do tempo. Para combinações de antimicrobianos foi demonstrado que a maioria das formulações apresentaram efeito sinérgico em P. aeruginosa, tanto em culturas planctónicas simples como mistas. Especialmente, quando aplicados em biofilmes, apenas as combinações AmB / PolyB e ToB / PolyB (particularmente com PolyB a elevadas concentrações: 256 mg/L), promoveram uma redução significativa no número de células viáveis e cultiváveis em ambas as estripes quer em biofilmes simples ou duplos. No entanto, a análise PNA FISH e a coloração LIVE/DEAD mostrou que ambas as estripes se encontravam presentes e viáveis na presença destas combinações antimicrobianas. Em conclusão, as diferentes terapias antimicrobianas usadas neste trabalho não apresentaram grande eficácia no tratamento de infeções polimicrobianas associados à PAV. No entanto, certas combinações antimicrobianas, já testadas neste trabalho, são essenciais para estudos futuros, a fim de melhor clarificar as concentrações de dosagem clínicas. Apesar das concentrações acima referidas serem tóxicas para os seres humanos estas apresentam forte potencial para serem usadas em futuras metodologias na terapia PAV.